粘着斑激酶的原核表达、纯化及抗体的制备

论文摘要

粘着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）是细胞质内单亚基非受体型酪氨酸激酶,通过各种信号途径参与调节细胞生长、发育、黏附、细胞骨架重组、转化、扩散和迁移等过程。—采用PCR方法,从Flag-FAK质粒中克隆编码FAK C端273个氨基酸的基因片段,构建FAK融合蛋白原核表达载体PET28a（+）/FAK,进行原核表达与蛋白纯化,取纯化的FAK蛋白免疫小鼠,制备FAK抗血清。结果表明构建了表达FAK C端功能结构域的原核表达质粒PET28a（+）/FAK,经过BL21（DE3）大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,获得分子量约33 kDa的融合蛋白。EL ISA检测显示该蛋白有较高效价。荧光免疫结果显示此多克隆抗体与FAK蛋白特异性结合,为进一步研究神经细胞中FAK的作用机制及奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 FAK 的结构
• 1.2 FAK 的功能
• 1.2.1 增强细胞的黏附、铺展和迁移
• 1.2.2 调节细胞增值与胚胎正常发育，阻止细胞凋亡
• 1.2.3 参与肿瘤细胞的发生、发展、侵袭、转移
• 1.3 FAK 介导的信号转导
• 1.3.1 FAK 上游信号分子及其通路
• 1.3.2 FAK 下游的信号分子及其通路
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒和菌种
• 2.1.2 化学试剂
• 2.1.3 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 原核表达载体pET-28a（+）-FAK 的构建
• 2.2.2 FAK 基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.3 FAK 融合蛋白的分离纯化
• 2.2.4 FAK 融合蛋白抗体的制备及抗体效价的检测
• 3 结果
• 3.1 原核表达质粒pET-28a（+）-FAK 的构建
• 3.2 原核表达质粒pET-28a（+）-FAK 的鉴定
• 3.3 FAK 基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 3.4 FAK 融合蛋白的纯化
• 3.5 FAK 融合蛋白抗体效价的检测
• 3.5.1 FAK 融合蛋白抗体效价的 EILSA 检测
• 3.5.2 FAK 融合蛋白抗体效价的Western-blot 检测
• 3.5.3 NLT 细胞内源性FAK 抗血清的免疫荧光染色
• 4 讨论
• 4.1 原核表达质粒pET-28a（+）-FAK 的构建
• 4.2 原核表达FAK 融合蛋白的获得
• 4.3 多克隆抗体FAK 的检测
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在学期间公开发表论文情况