植酸酶基因在pIAβ8和pGAPZαA两种载体中的表达及酶学特性分析

论文摘要

本研究旨在测定无花果曲霉植酸酶的酶学特性,克隆出无花果曲霉植酸酶的基因,构建原核和真核重组表达载体,比较两种重组表达载体在大肠杆菌中表达分泌的植酸酶酶活,从而选择最佳表达载体,为进一步生产转基因植酸酶奠定基础。无花果曲霉采用麸皮固体培养基发酵,利用生理盐水浸提植酸酶,通过离心、盐析、透析、层析纯化回收无花果曲霉植酸酶并测定其酶学特性。结果表明,其最适pH为2.5和5.5,最适合温度为50℃,该特性对于其作为饲料添加剂,被单胃动物利用降解植物性饲料中的植酸非常有利。本试验成功提取了无花果曲霉的基因组DNA,设计引物,利用PCR扩增出植酸酶的基因片段（1.4Kb）,纯化回收目的基因,并克隆到克隆载体PUCm-T中。经PCR检测,XbaⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定及DNA测序,证实插入片段的DNA序列与Genebank中已公布的植酸酶（Ref AY013315）成熟肽目标序列同源性达99.53%,克隆序列编码蛋白与目的序列的同源性为99.63%,且完整保留了酸性磷酸酶的活性中心编码蛋白序列。本次克隆的植酸酶基因序列已在Genebank上注册（Ref.EF206311）。将植酸酶基因从克隆重组表达载体上双酶切下来,与双酶切过的原核表达载体pIAβ8相连接。经PCR检测、酶切鉴定及表达的植酸酶活性测定,验证了植酸酶基因完整准确地插入原核表达载体中。同样地成功构建了pGAPZαA-phyA重组表达载体。通过两种重组表达载体分别在大肠杆菌中表达的植酸酶酶活比较,可得出pIAβ8-phyA重组表达载体可分泌表达胞内植酸酶（9.04 U/ml,P＜0.05）;而pGAPZαA-phyA重组表达载体可分泌表达胞外植酸酶（8.04 U/ml,P＜0.05）。SDS-PAGE电泳检测出两种植酸酶基因重组表达载体分别在大肠杆菌中可表达植酸酶蛋白,在54.61 KDa处均有亮带,且与商品植酸酶的位置相当。

论文目录

• 致谢
• 内容摘要
• Summery
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 植酸
• 1.1.1 植酸的分布
• 1.1.2 植酸的性质和结构
• 1.1.3 植酸的抗营养作用
• 1.1.3.1 影响磷的消化与吸收
• 1.1.3.2 影响矿物元素的利用
• 1.1.3.3 影响蛋白质吸收及消化酶的活性
• 1.1.3.4 植酸抗营养作用的消除
• 1.2 植酸酶
• 1.2.1 植酸酶的来源
• 1.2.2 植酸酶的分类
• 1.2.3 植酸酶的作用机理
• 1.2.4 植酸酶的酶学特性
• 1.2.5 植酸酶的酶活测定
• 1.2.6 植酸酶的功能
• 1.3 植酸酶的研究进展
• 1.3.1 植酸酶的高级结构
• 1.3.2 植酸酶基因
• 1.3.3 真菌植酸酶基因的分子生物学研究
• 1.3.3.1 真菌植酸酶基因的分子生物学征
• 1.3.3.2 真菌植酸酶基因ORF编码的多肽、信号肽及其糖基化位点
• 1.3.4 植酸酶的基因工程
• 第二章 无花果曲霉生产的植酸酶酶活特性的研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 仪器设备
• 2.1.2 菌种与质粒
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 溶液配制
• 2.2 方法和步骤
• 2.2.1 无花果曲霉培养
• 2.2.2 发酵培养
• 2.2.3 取样
• 2.2.4 标准磷测定曲线的制作
• 2.2.5 植酸酶活性的测定
• 2.2.6 纯化
• 2.2.7 盐析
• 2.2.8 透析
• 2.2.9 离子交换剂的层析处理
• 2.2.10 利用SDS-PAGE电泳测定层析前和层析后的酶纯度的情况
• 2.2.10.1 SDS-PAGE凝胶的配制
• 2.2.10.2 电泳样品的制备与处理
• 2.2.10.3 染色及脱色
• 2.2.11 不同温度测酶活
• 2.2.12 不同pH值测酶活
• 2.2.13 数据处理
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 无花果曲霉产植酸酶随生长时间的变化
• 2.3.2 不同温度对无花果曲霉植酸酶酶活的影响
• 2.3.3 不同pH值对无花果曲霉植酸酶酶活的影响
• 2.3.4 无花果曲霉植酸酶纯化后的酶纯度检测
• 2.4 讨论
• 2.4.1 无花果曲霉的应用
• 2.4.2 无花果曲霉植酸酶的酶学特性应用
• 2.4.3 植酸酶活性的测定方法
• 第三章 植酸酶基因的克隆及鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 仪器设备
• 3.1.2 菌种与质粒
• 3.1.3 酶与试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 溶液配制
• 3.2 方法和步骤
• 3.2.1 无花果曲霉（A.ficuum）总DNA的提取
• 3.2.2 植酸酶cDNA的克隆
• 3.2.2.1 PCR引物设计
• 3.2.2.2 PCR扩增
• 3.2.2.3 PCR产物纯化回收
• 3.2.2.4 植酸酶基因与PUCm-T载体的连接
• 3.2.2.5 连接产物的转化
• 3.2.2.6 克隆植酸酶DNA片段的鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 植酸酶重组克隆的蓝白斑筛选
• 3.3.2 植酸酶重组克隆的鉴定
• 3.3.3 克隆基因片段的序列分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 植酸酶基因的分离及意义
• 3.4.2 植酸酶氨基酸序列分析
• 第四章 植酸酶基因原核pIAβ8表达载体的构建
• 4.1 材料
• 4.1.1 仪器设备
• 4.1.2 菌种与质粒
• 4.1.3 质粒pIAβ8的物理图谱
• 4.1.4 酶与试剂
• 4.1.5 培养基
• 4.1.6 溶液配制
• 4.2 方法和步骤
• 4.2.1 植酸酶基因原核表达载体pIAβ8的构建
• 4.2.1.1 植酸酶基因的回收
• 4.2.1.2 原核表达载体质粒pIAβ8双酶切大片段的回收
• 4.2.1.3 植酸酶基因和原核表达载体质粒pIAβ8的连接
• 4.2.1.4 连接产物的转化
• 4.2.1.5 重组载体质粒的鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 植酸酶重组克隆的蓝白斑筛选
• 4.3.2 植酸酶重组克隆的鉴定
• 4.4 讨论
• 第五章 植酸酶基因真核pGAPZαA表达载体的构建
• 5.1 材料
• 5.1.1 仪器设备
• 5.1.2 菌种与质粒
• 5.1.3 质粒pGAPZαA的物理图谱
• 5.1.4 酶与试剂
• 5.1.5 培养基
• 5.1.6 溶液配制
• 5.2 方法和步骤
• 5.2.1 植酸酶基因真核表达载体的构建
• 5.2.2.1 植酸酶基因的回收
• 5.2.2.2 真核表达载体pGAPZαA质粒的回收
• 5.2.2.3 植酸酶基因和真核表达载体质粒pGAPZαA的连接
• 5.2.2.4 连接产物的转化
• 5.2.2.5 重组载体质粒的鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 植酸酶真核表达载体重组克隆的抗生素筛选
• 5.3.2 植酸酶重组克隆的鉴定
• 5.4 讨论
• 第六章 植酸酶基因在不同表达载体中表达的酶活比较
• 6.1 材料
• 6.1.1 仪器设备
• 6.1.2 菌种与质粒
• 6.1.3 培养基
• 6.1.4 溶液配制
• 6.2 方法和步骤
• 6.2.1 表达宿主菌的培养
• 6.2.2 样品处理
• 6.2.3 植酸酶酶活的测定
• 6.2.4 SDS-PAGE电泳检测
• 6.2.5 数据处理
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 两种植酸酶基因重组表达载体分别在大肠杆菌中表达的植酸酶酶活比较
• 6.3.2 两种植酸酶基因重组表达载体分别在大肠杆菌中表达的胞内植酸酶酶活比较
• 6.3.3 两种基因重组表达载体分别在大肠杆菌中表达的植酸酶蛋白检测
• 6.4 讨论
• 总结
• 参考文献