日本血吸虫ARGONAUTE蛋白（AGO）家族成员AGO2和AGO3的初步研究

论文摘要

血吸虫病人畜共患,其分布广泛,危害严重。目前,血吸虫病防治工作仍是世界卫生组织高度重视的当前要务。吡喹酮是治疗血吸虫病首选药物,由于长期大量使用该种药物使得耐药虫株的产生,加之血吸虫重复感染问题严重,单靠药物不能解决再度感染感染的问题。新药研制需要花费巨大财力物力,其治疗效果也不能达到预期效果。发展血吸虫疫苗是综合防治血吸虫病的重要发展战略,血吸虫疫苗研制也是世界卫生组织优先考虑防治血吸虫病的重要举措。近几十年来血吸虫的防治取得了突破性的进展。但是疫苗的研究效果也未取得突破性进展,还未达到世界卫生组织提出的达到40%-50%的免疫效果。因此,继续筛选有效药物靶标和抗血吸虫疫苗成为研究热点。本研究利用RACE技术获得了两个编码日本血吸虫Argonaute蛋白（AGO）的全长cDNA,生物信息学分析表明这两个蛋白均具有PAZ和PIWI两功能域,为Argonaute家族蛋白的典型特征。同源比对以及进化树分析两蛋白分别与曼氏血吸虫AGO2和AGO3有很高的同源性,推测为日本血吸虫AGO家族蛋白AGO2和AGO3。将编码日本血吸虫AGO蛋白两基因片段克隆到pET-28a（+）载体中构建原核表达质粒,并转化BL21。利用原核表达系统成功表达了重组蛋白,纯化重组蛋白并制备了高效多克隆抗体。本研究利用实时定量PCR（RT-PCR）分析AGO蛋白在血吸虫7d、14d、21d、32d、42d不同时期转录情况。结果表明两蛋白在血吸虫各时期均有转录。初步分析AGO2和AGO3相对其它时期21d、42d有较高转录水平。利用westen blot分析AGO蛋白在血吸虫7d、14d、21d、32d、42d、28d♀和28d（?）表达情况。在各个时期都能观察到多克隆抗体和血吸虫AGO蛋白特异结合条带。结果表明AGO蛋白在血吸虫成虫时期表达量较高,且雌雄差异表达分析表明,雄虫高表达。本研究获得了两个编码日本血吸虫AGO全长cDNA,对其初步研究为进一步深入研究AGO蛋白在日本血吸虫生长发育中的功能及以此为切入点为开发新的抗血吸虫药物靶标和疫苗分子奠定了初步基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 日本血吸虫及其生活史
• 1.2 血吸虫的危害
• 1.3 日本血吸虫在我国流行及防治
• 1.4 血吸虫疫苗研究现状
• 1.4.1 虫源性疫苗
• 1.4.2 合成肽疫苗
• 1.4.3 抗独特型抗体疫苗
• 1.4.4 基因工程疫苗与核酸疫苗
• 1.5 展望
• 1.6 Argonaute蛋白（AGO）的研究
• 1.6.1 AGO对miRNA和siRNA的选择性
• 1.6.2 AGO与Dicer之间的作用
• 1.7 小结
• 第二章 日本血吸虫Argonaute蛋白（AGO）家族成员AGO2和AGO3的研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂和酶
• 2.1.2 菌种和实验动物
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA提取
• 2.2.2 3'RACE和5'RACE基因特异引物
• 2.2.3 3'RACE反应所需RNA的处理
• 2.2.4 3'RACE套式PCR反应扩增SjAGO2、SjAGO3基因3'末端
• 2.2.5 5'RACE反应所需RNA的处理
• 2.2.6 5'RACE套式PCR反应扩增SjAGO2、SjAGO3基因5'末端
• 2.2.7 全长序列拼接
• 2.2.8 AGO2、AGO3重组质粒的构建
• 2.2.9 SDS-PAGE分析重组蛋白在大肠杆菌中表达时相
• 2.2.10 重组蛋白大肠杆菌中大量表达
• 2.2.11 重组蛋白的纯化
• 2.2.12 SjAGO2、SjAGO3蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体
• 2.2.13 Western blot分析血吸虫全虫蛋白与多克隆抗体特异性反应
• 2.2.14 实时定量分析SjAGO3在血吸虫不同时期的转录情况
• 2.2.15 Western blot分析SjAGO2和SjAGO3蛋白不同时期表达情况以及雌雄虫中表达差异
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 SjAGO2、SjAGO3 RACE结果
• 2.3.2 SjAGO2、SjAGO3蛋白的全长cDNA及生物信息学分析
• 2.3.3 AGO2、AGO3重组蛋白表达
• 2.3.4 ELISA检测不同时间抗AGO2、AGO3 IgG变化情况
• 2.3.5 Western blot分析多克隆抗体和日本血吸虫全虫蛋白特异结合
• 2.3.6 AGO3不同时期转录分析
• 2.3.7 AGO2、AGO3不同时期以及雌雄虫表达差异分析
• 2.4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表的文章
• 附录1