论文摘要
研究背景与目的各种疾病造成的角膜基质不可逆性混浊是视力丧失的主要原因,在致盲病因中位居第二,仅次于白内障。角膜盲最有效的治疗方法是穿透性角膜移植,但是供体来源不足、免疫排斥反应、角膜移植并发症等限制了此项技术的开展。有些角膜移植的高危患者,如角膜缘干细胞缺损导致的严重干眼症,是角膜移植的绝对禁忌症。因此有必要寻找一种新的角膜替代物。角膜替代物主要分为二类:人工角膜和组织工程角膜等效物（TECE）。TECE是以细胞为基础构建的活性替代物,主要由天然角膜的三种细胞和胶原成分构成。构建组织工程角膜等效物的关键是支持细胞三维生长的支架材料。以胶原为基础的天然生物聚合胶表现了极好的生物学特性,支持细胞三维生长,已经被广泛应用于组织工程技术。目前尚无以此构建的TECE临床应用的报道,主要原因是胶原韧性差,不耐受缝合。去细胞处理的异种组织主要成分为胶原、弹力纤维等,形态与韧性变化较小。而且去细胞处理可以降低异种组织的炎症反应和免疫排斥反应,扩充组织来源。在组织工程技术和再生医学研究中,去细胞生物支架材料如心脏瓣膜、血管、皮肤、神经、骨骼肌、腱膜、韧带、小肠粘膜下组织、膀胱和肝脏,已经进入临床前期动物实验或临床治疗阶段。我课题组先期研究中利用酶-去污剂联合方法对猪角膜基质进行去细胞处理,冻干或无水氯化钙脱水保存,生物相容性好,可修复无菌性角膜溃疡、角膜化学烧伤（碱烧伤）;缺点是有去污剂残留可能,材料透明度差。本研究旨在①改进去细胞方法与保存方式,与去污剂处理的材料在生物相容性和透明度方面进行比较;②利用单纯CAM板层移植或全层移植修复兔角膜溃疡;③以CAM为支架体外构建TECE,观察TECE在大鼠穿透性角膜移植模型中对新生血管的抑制作用。内容与方法1.CAM的制备取自当地屠宰场的新鲜猪眼球100个,沿角巩膜缘切取角膜,低渗处理后剖分为两部分,用10-0单丝尼龙线标记前弹力层面和后弹力层面。通过冻融、酶消化（胰酶、核酸酶）、机械搅拌等处理去除组织内的细胞成分。HE组织学染色检测去细胞情况,取一片晾干材料进行扫描电镜检测。2.CAM生物相容性评价22只雄性新西兰白兔,体质量2-2.5kg,2只新生兔。CAM体外接种兔角膜基质细胞、角膜基质囊袋内植入、前房内植入观察其相容性。3.单纯CAM为植片修复兔角膜溃疡于术前一周制备兔角膜溃疡模型。12只角膜溃疡兔随机分为二组,分别接受板层或全层移植治疗,排除穿透性移植术中出现并发症的1例,术后进行裂隙灯显微镜、超声生物显微镜、透射电镜检查和光镜检查。4.体外构建TECE,观察穿透性移植后对新生血管的抑制作用SD大鼠20只,体质量200-250g,雌雄不限。随机分为2组,分别接受单纯CAM为植片、TECE为植片的穿透性角膜移植。利用PKH26标记的新生鼠角膜上皮细胞与基质细胞接种于CAM上,气液面培养构建TECE。于术后2、4、8、16、20周取材进行HE组织学染色检查,冰冻切片荧光显微镜检查,24周TECE组进行透射电镜检查。结果1.CAM大体形态及组织学观察改进方法处理的CAM几乎透明,表面光滑,韧性强,可缝合,但缺乏天然角膜曲率。HE提示去细胞彻底,胶原板层保存完好,扫描电镜提示材料表面有基底膜样结构。冻干或无水氯化钙脱水保存的CAM不透明,表面粗糙,胶原有断裂,孔隙约200μm。2.CAM相容性检测体外接种角膜基质细胞,7天时HE染色见CAM表面有单层细胞附着。前房内、角膜囊袋内植入术后1个月取材,提示CAM在基质内未引起免疫排斥反应,但是无角膜基质细胞长入CAM微孔内;植入前房的CAM表面有成纤维细胞包绕。3.单纯CAM移植后细胞再生所有植片均可见自体细胞再生。术后1-2周,角膜上皮细胞层开始重建,荧光素钠染色不均,有不规则的角膜上皮缺失,修复的角膜上皮来源于角巩膜缘、周边植床。4周时角膜上皮融合,复层化。扫描电镜提示角膜基质细胞进入胶原板层,分泌胶原原纤维。术后4-7天出现角膜新生血管,14-20天角膜血管翳越过植床植片交界处,32周时新生血管明显消退。板层移植角膜植片15个月后透明,恢复自然曲率。4.TECE体外构建与体内移植角膜上皮细胞、基质细胞在CAM表面匍行贴附生长,移植后取材见角膜上皮细胞复层化,与正常角膜上皮细胞相似,但是无红色荧光标记;角膜基质细胞转化为成纤维细胞,沿胶原板层浸润,并分泌新生胶原纤维;TECE对角膜新生血管有明显的抑制作用;24周植片扫描电镜检查有神经纤维长入。结论1.去细胞彻底,CAM具有良好的力学及光学性能采用低渗、冻融、酶消化法进行和缓的去细胞处理,能够彻底去除细胞,减小对ECM的损伤,保留基底膜、后弹力层;改为晾干保存,有利于提高CAM力学及光学性能。2.组织相容性好改进方法处理的CAM无有害物质残留,无免疫源性,组织相容性良好,角膜囊袋内移植后CAM降解速度缓慢,足以支持自体角膜组织再生与重建。3.CAM可以修复兔角膜溃疡CAM原位移植后,诱导自体上皮细胞复层化,基质细胞能够沿胶原板层移行,并分泌胶原原纤维。最终植片透明,恢复自然角膜曲率。4.TECE抑制角膜新生血管预先接种了上皮细胞与基质细胞的TECE增强了手术创口的抗炎能力,能够抑制角膜植片新生血管发生,支持角膜神经的修复与重建。综上所述,晾干CAM具有良好的生物相容性,韧性强,透明度高,体内支持细胞三维生长,能与自身分泌的胶原整合,支持神经纤维重建,植片最终透明,恢复自然曲率;单纯的CAM穿透性或板层移植可以治疗兔角膜溃疡;晾干CAM材料适宜长期保存,用前复水即可,因此具有制备、储存、运输便利的优点,是一种很有希望的组织工程角膜支架材料。