论文摘要
心脏疾病一直是严重威胁人类健康的重大疾病之一,通常认为,心肌细胞在出生后不能再生,损伤死亡后,健存心肌通过肥大加以代偿,梗死心肌被瘢痕组织替代,发生心室重构,最终导致心力衰竭。现有治疗手段诸如药物、介入、外科手术等并不能促使心肌再生,治疗效果十分有限。心脏移植由于供体心脏来源有限、费用昂贵及移植排斥反应等问题也限制了其推广应用。而细胞移植为心脏坏死区细胞重建及衰竭心脏功能恢复提供了一种崭新方法。胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ES cells）能在体外长期传代培养并保持高度未分化,给予合适培养条件,可在体外分化为外、中、内胚层任何类型细胞。研究证明,ES细胞体外向心肌细胞分化特异基因表达图式重演了体内心肌发育基因表达,分化得到心肌细胞具有体内正常心肌或原代培养心肌特征和功能。因此,ES细胞体外定向分化为心肌细胞已逐渐成为公认的体内心肌分化替代模型用于各种目的研究,如心脏发育生理学、心脏病理学及心脏疾病治疗学等。在药物研究领域,通过在谱系特异启动子控制下基因敲入表达报告基因（通常为胎蛋白或荧光酶）,ES细胞可提供高通量筛选平台,确定能诱导ES细胞定向分化为初级前体细胞的先导化合物。对先导进行药效基团优化,可获得低分子量化合物控制初级前体细胞分化。按照此模式可筛选使特定后期前体细胞分化为终端成熟细胞的化合物,而终端成熟细胞（如心肌细胞,特定神经细胞亚型）对特异性作用药物发现非常有价值。尽管人们对ES细胞及其心肌细胞定向分化的认识和利用已有了长足进步,但仍存在一系列悬而未决的问题或发展中的“路障”。目前对于ES细胞诱导分化为心肌细胞准确调控机制尚不清楚,培养与诱导条件没有统一标准。人们还不能完全控制ES细胞定向分化为心肌细胞,还不知道ES细胞定向分化时是否有基因突变发生。只有准确掌握ES细胞分化调控机制,才有可能在分子水平上精确诱导ES细胞定向分化成心肌细胞,并消除一些不利因素。具有诱导ES体外定向分化心肌细胞作用的小分子化合物的发现,为ES细胞基础研究及临床应用提供了强有力的研究工具。这些小分子化合物作用机制的阐明不仅有助于控制ES细胞命运,同时还可以提高心肌细胞诱导分化率,这不仅是ES细胞临床治疗必需,而且有助于心脏发育早期分子机制研究,也是进行新药创新重要手段。ES细胞是目前细胞工程研究最活跃领域,随着基础、应用研究的进一步深化,利用化学小分子化合物诱导ES细胞定向分化技术会在相当大程度上引发医学领域的重大变革,成为21世纪生命科学领域热点。本课题前期研究发现,淫羊藿苷（ICA）及其同系物淫羊藿素（ICT）和去甲淫羊藿素（DICT）均能有效促进小鼠ES细胞体外定向分化为心肌细胞,作用强度依次为ICA＞ICT＞DICT,并且细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）在ICA诱导分化过程中扮演了重要角色。相反,对三者体外抗氧化活性研究显示,DICT体外抗氧化活性最强,ICT次之,ICA在体外几乎不表现抗氧化活性。ICA,ICT和DICT均为异戊烯基黄酮类化合物,研究显示,当基本结构相同时,黄酮类化合物的抗氧化活性往往与结构有关。ICA,ICT和DICT结构差异导致的体外抗氧化活性差异是否是其促分化效果不同的原因,尚未被证实。因此,本研究拟通过考察ICA,ICT和DICT对ROS信号通路的调控作用,初步对其促分化作用构效关系进行研究,以期揭示此类异戊烯基黄酮化合物促分化作用物质基础,为新的促心肌定向分化先导化合物发现提供依据。进一步我们对其相关信号调控进行了研究,为揭示ICA,ICT和DICT促心肌定向分化深层次机制,阐明其诱导分化药理作用提供实验依据,也为发展其新应用提供理论支持。1 ICA及其同系物诱导ES细胞定向分化心肌细胞构效关系研究为探索ICA、ICT和DICT诱导ES细胞体外定向分化心肌细胞构效关系,本研究考察了ICA和ICT启动心肌定向分化过程中对ROS信号通路调控作用,采用荧光分光光度计检测了ICA和ICT对拟胚体（embryoid bodies,EBs）内ROS水平影响。共孵育抗氧化剂vitamin E或pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC）,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶抑制剂apocynin,评价ROS在ICA促心肌定向分化中作用及其与NADPH氧化酶关系。Western blot和免疫荧光法检测ICA和ICT作用后胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）、c-Jun氮末端蛋白激酶（c-junN-terminal kinase,JNK）和丝裂素活化蛋白激酶p38（mitogen-activated proteinkinase p38,p38MAPK）磷酸化水平变化,并观察选择性抑制p38MAPK及ERK后对ICA诱导心肌细胞定向分化的影响。同时考察ICA和ICT介入后,NOX4NADPH氧化酶基因及蛋白表达。实验结果显示,ICA作用EBs 2h后能显著提高细胞内ROS水平,当体系中共孵育vitamin E,PDTC或apocynin时,ICA促ROS产生作用消失。选择性清除细胞内ROS显著抑制ICA促心肌细胞定向分化作用,表现为心肌分化率降低,肌细胞增强因子2C（myocyte enhancer factor 2C,MEF2C）基因表达减少。p38MAPK和ERK1,2磷酸化水平分别在ICA介入培养体系30 min或2 h后上升至最高,而JNK磷酸化水平在观察的0～4 h内无明显变化。上述ICA诱导的丝裂素活化蛋白激酶（MAPKs）激活作用均可被vitamin E拮抗。p38MAPK抑制剂SB203580或ERK1,2抑制剂U0126对信号通路进行选择性抑制后,能有效拮抗ICA促分化作用,表现为心肌细胞分化率显著降低,心肌MEF2C基因表达显著减少。进一步研究显示,ICA和ICT介入分化体系30min后能显著增加Nox4 NADPH氧化酶基因表达,作用2 h后能明显上调其蛋白表达,但ICA和ICT对其诱导效应无显著差异。ICT作用后EBs内活性氧升高水平,p38MAPK和ERK1,2磷酸化程度均较ICA组少。提示ICA和ICT具有同等效应激活细胞内ROS作用（对NOX4 NADPH氧化酶诱导作用相似）,ICT本身具备的抗氧化活性在激活NOX4同时清除了部分ROS,从而导致其下游p38MAPK和ERK1,2激活效应削弱,最终导致其促心肌细胞定向分化作用相对较弱。本实验结果提示ICA、ICT和DICT促心肌细胞体外定向分化作用物质基础是其母核本身,但母核上羟基位置与数目差异导致的抗氧化活性差异影响了其诱导小鼠ES细胞体外定向分化心肌细胞效应。2 ROS信号通路在ICA启动心肌细胞定向分化中作用研究第一部分研究从化合物构效关系层面进一步明确了细胞内ROS水平在ES细胞体外定向分化心肌细胞中的作用,基于上述研究结果,为进一步明确ROS信号通路在ICA促心肌细胞定向分化过程中的角色,本部分着重对核因子-κB（nuclearfactor-κB,NF-κB）,活性蛋白（activation protein-1,AP-1）,及Ca2+信号通路进行了考察。采用Western blot法检测ICA介入体系后IκBα和p-IκBα表达,胞质和胞核内NF-κB p65表达,及c-fos和c-jun表达。荧光分光光度计法检测ICA和ICT介入后对EBs内Ca2+水平影响,共孵育Ca2+螯合剂EGTA或胞内Ca2+清除剂BAPTA/AM后,评价EBs内Ca2+水平对ICA促心肌细胞定向分化作用影响。Westernblot法检测ICA介入后EBs内钙调神经磷酸酶（calcineurin,CaN）及钙调蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ,CaMKⅡ)表达,并观察选择性抑制CaN及CaMKⅡ后对ICA诱导ES细胞体外定向分化为心肌细胞影响。进一步考察ICA介入后EBs内组蛋白去乙酰基转移酶4（histone deacetylases 4,HDAC4）表达及其与CaMKⅡ关系。最后,共孵育vitamin E、SB203580或U0126,评价ICA诱导心肌细胞体外定向分化过程中ROS-MAPKs信号通路与NF-κB、AP-1及Ca2+信号通路关系。结果显示,ICA作用30 min后,EBs内p-IκBα表达显著增加,IκBα表达显著减少。ICA与EBs共孵育2 h后,胞核内NF-κB p65表达显著增加,胞浆中表达相应减少。c-fos和c-jun基因或蛋白表达在ICA作用30min或2 h后显著上调。ICA介入5 min后细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)即显著上升,共孵育EGTA或BAPTA/AM后,发现其能有效拮抗ICA促心肌细胞体外定向分化作用,表现为心肌分化率降低,心肌MEF2C核转录减少,肌小节蛋白α-辅肌动蛋白（α-actinin）和肌钙蛋白T（Troponin-T）表达下调。ICA作用48 h后CaN及CaMKⅡ表达显著上升,此作用可被EGTA或BAPTA/AM拮抗。选择性抑制CaMKⅡ显著拮抗ICA促分化作用,但CaN抑制后对ICA促分化作用并无显著影响。ICA作用48 h后HDAC4表达显著降低,选择性抑制CaMKⅡ后能显著抑制ICA降低HDAC4表达作用。共孵育vitamin E后,发现其能有效拮抗ICA诱导的NF-κB,Ap-1激活和[Ca2+]i增加。SB203580或U0126对信号通路进行选择性抑制后,ICA诱导NF-κB和AP-1激活作用明显降低,但对[Ca2+]i无显著影响。结果提示,ICA促进ESN胞体外定向分化为心肌细胞过程中,一方面,激活的ROS通过p38MAPK和ERK1,2传递信号,使NF-κB抑制因子IκBα发生自身磷酸化并迅速降解,NF-κB和IκBα解离,转位进入细胞核,同时,活化的p38MAPK和ERK1,2上调c-fos和c-jun表达;另一方面,ROS通过激活细胞内Ca2+,活化CaMKⅡ,导致下游HDAC4降解,其对MEF2C的转录抑制作用降低,MEF2C转录活性增加,从而促进心肌分化。以上实验表明:1.ICA、ICT和DICT促ES细胞体外定向分化心肌细胞作用与其母核本身密切相关,但母核上羟基位置与数目差异导致的抗氧化活性差异,可影响该类化合物诱导心肌细胞定向分化效应的强弱。2.ICA促进EBs向心肌细胞分化过程中,内源性ROS水平迅速升高,一方面,激活的ROS通过p38MAPK和ERK1,2传递信号,使NF-κB抑制因子IκBα发生自身磷酸化并迅速降解,NF-κB和IκBα解离,转位进入细胞核,同时,活化的p38MAPK和ERK1,2上调c-fos和c-jun表达;另一方面,ROS通过激活细胞内Ca2+,活化CaMKⅡ,导致下游HDAC4降解,其对MEF2c的转录抑制作用降低,MEF2C转录活性增加,从而促进心肌分化。