SSC15上繁殖候选基因的分离、鉴定及表达差异研究

论文题目: SSC15上繁殖候选基因的分离、鉴定及表达差异研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 杜红丽

导师: 张细权

关键词: 定位,繁殖性状,候选基因,分离,鉴定,关联分析,表达差异

文献来源: 华南农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 繁殖性状是非常重要的经济性状,本研究通过比较基因组学、电子克隆、RH定位、测序、多态性与产仔性状关联分析以及基因表达差异检测等方法,分离、鉴定猪15号染色体（SSC15）上影响产仔性状的候选基因,进一步对试验所确定的候选基因以及其它13个与繁殖性能相关的基因进行表达差异研究,从mRNA水平上提供依据检验这些基因是否影响产仔性能,并阐述其影响产仔性能可能的分子机理,研究结果如下:（1）以人2号染色体（HSA2）2q23-q37区间的同源基因mRNA序列为探针,从GenBank中搜索猪的同源ESTs,利用EST或ESTs构成的连接群（contig）设计引物进行PCR反应,产物用上下游引物双向测序,从二花脸、大花白、长白和杜洛克猪基因组中分离得到21个基因（分别是ACVR1、ARHE、CED-6、CMYA3、COL4A4、DPP4、EPHA4、FLJ11457、GAD1、HAT1、HES6、HSPE1、KCNJ3、KLF7、NFE2L2、NR4A2、NRP2、ORC2L、SH3BP4、SP3、TRIP12）的部分序列,序列总长度8943 bp,各基因序列与相应的人mRNA序列的同源性均大于80%（82%～96%）。所测序列递交到GenBank收录,84个序列收录号为AY805665至AY805748的连续号码。（2）利用IMpRH杂种板将分离的21个基因进行染色体定位,结果表明这些基因均与SSC15上的基因或标记紧密连锁,除ARHE基因（与SW2072紧密连锁,LOD=6.61）外其它基因定位的LOD值均大于8;21个基因除ARHE外基本都被定位在控制排卵率的QTL区间内,其中KLF7、NRP2和ORC2L被定位到十分接近51 cM的位置,EPHA4、COL4A4和TRIP12三个基因的位置与79 cM位置最接近;这些猪的基因与人和鼠的比较而言,除了DPP4、ACVR1、NR4A2、KCNJ3 4个基因顺序出现倒置之外,其余基因的顺序在猪、人、鼠染色体上都是保守的;HSA2与SSC15上出现重排的区域可能扩大到HSA2q11-23与SSC15q11-15区域,出现重排的非着丝粒端的位置可能在HSA2q23.3区间ARHE基因之后的区域;进一步完善了的SSC15 IMpRH图谱以及与人的比较基因图谱对今后SSC15上QTL位置潜在候选基因的分离有极大帮助。（3）以4个产仔性能具有明显差异的猪品种（二花脸、大花白、长白和杜洛克猪）为材料,利用DNA池和测序技术快速筛查可能与猪繁殖性能相关的多态,结果成功地在SSC15上8943 bp的区域内检测到19个序列多态,其中包括13个SNPs和6个插入/缺失多态,平均每470 bp有一个多态位点,每688 bp有一个SNP位点。（4）利用PCR-RFLP检测了6个基因7个多态位点（DPP4-1、SH3BP4-2、ORC2L、NRP2、COL4A4-2、COL4A4-3、TRTP12）在二花脸、大花白、长白和杜洛克猪群（共237个体）中的分布情况,并进行了连锁不平衡和标记性状关联分析。连锁不平衡分析发现,ORC2L位点和NRP2位点在研究群体中紧密连锁形成单倍型块,SSC15上影响产仔性能的QTN极可能处于ORC2L和NRP2两位点附近或者就是这两个位点本身。（5）上述7个多态位点基因型与产仔性能的关联分析发现,NRP2多态位点与产仔数性状的相关性接近显著水平（P=0.0614）,与产活仔数性状达到显著相关（P=0.0198）,结合连锁不平衡、基因频率、基因定位等分析结果以及基因的功能推断,NRP2是猪产仔性能（产仔数和产活仔数性状）的候选基因。（6）结合单倍型组合（K:COL4A4-2和COL4A4-3组成;H:ORC2L和NRP2组成）与产仔性状的关联分析结果和单倍型在各品种中的分布情况,发现K1（CT）和H4（IT）可能是利于产仔的优势单倍型,而K3（TA）可能是不利于产仔的劣势单倍型。（7）以人NM201266和NM018534（不同的剪切形式）为种子序列BLAST猪ESTs ,并将得到的ESTs各自构建EST contig,分别得到5条和4条大小不一的contigs,利用DNASTAR软件及人NM20126 6和NM018534序列将各自对应的猪EST contigs拼接起来,虽然两种形式的序列都还留有一点Gap区,但已有足够的序列信息设计引物来调取猪NRP2的全长cDNA序列。（8）利用电子克隆和测序的方法初步发现并验证了类似于人NM201266、NM003872和NM201267的猪NRP2 3种mRNA剪切形式。（9）利用real time PCR检测NRP2的组织表达情况,发现发情阶段的二花脸和杜洛克的垂体、卵巢、子宫、输卵管、心、肝、脾、肺、肾、皮、脂、肌、脑、肠、胃组织中均有NRP2表达,而且二花脸的总体表达水平比杜洛克高。（10）NRP2-1和NRP2-2在发情期二花脸卵巢、子宫、输卵管中的表达量均大于杜洛克相应组织的表达量,推测NRP2表达水平高可能有利于提高产仔数,但两品种间表达差异不明显,推测NRP2影响产仔数的关键阶段可能不是猪的发情期;另外,NRP2是神经轴突介导因子的受体,这些神经轴突转导的信号往往有级联放大的功能,虽然NRP2-1和NRP2-2在二花脸和杜洛克卵巢、子宫、输卵管中的表达差异不大,但二花脸有可能通过神经系统转导信号的级联放大最终引起一些效应激素或蛋白的急剧增加,从而提高排卵率或产仔数。（11）检测了包括NRP2在内的14个基因在二花脸和杜洛克中的表达差异,其中有12个基因（IGF1、P450arom、ESR、FSHR、EGF、PAPP-A、DDP4、NRP2、GnRHR、INHA、PRLR、RBP4）在二花脸子宫的表达量均高于杜洛克子宫的表达量,尤其是RBP4和ESR（相对定量结果为分别为123.35和10.67）表现得最为明显,推测RBP4和ESR对二花脸早期胚胎的存活可能有促进作用,由此也可以看出二花脸猪的高产仔性状是受多个基因综合作用的结果。

论文目录:

摘要

常用缩写词

前言

第一章 SSC15 上21 个新基因的分离与RH 定位

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 DNA 样品

1.1.2 主要仪器设备

1.1.3 主要试剂及配制

1.1.4 主要分子生物学软件

1.2 试验方法

1.2.1 用于基因分离和RH 定位的引物设计

1.2.2 分离基因的RH 定位

2 结果与分析

2.1 基因片段的分离

2.1.1 21 对引物PCR 扩增结果

2.1.2 PCR 产物纯化、测序和DNA 序列同源性检索鉴定

2.2 21 个基因RH 定位结果

2.2.1 RH 定位的PCR 扩增分型

2.2.2 RH 定位的数据分析

2.3 猪、人和鼠21 个基因染色体位置的比较分析

3 讨论

3.1 RH 定位的引物设计

3.2 本实验RH 定位的可靠性

3.3 猪21 个基因的定位结果及与人和鼠比较分析

4 小结

第二章 SSC15 部分基因多态及与产仔性能的相关性分析

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试样本

1.1.2 主要仪器设备

1.1.3 主要试剂及配制

1.2 试验方法

1.2.1 猪基因组 DNA 抽提

1.2.2 利用DNA 池测序验证基因序列并快速筛查序列多态

1.2.3 SSC15 部分基因多态与猪产仔性能的相关性分析

2 结果与分析

2.1 PCR 产物测序与序列BLAST 分析

2.2 基因序列多态的确定

2.3 SSC15 部分基因多态与猪产仔性能的相关性分析

2.3.1 基因多态分型结果

2.3.2 连锁不平衡分析结果

2.3.3 基因型频率和基因频率统计结果

2.3.4 多态位点与产仔性能关联分析结果

3 讨论

3.1 基因序列多态的筛查

3.2 SSC15 上多态位点与猪产仔性能的相关性

3.2.1 SSC15 上多态位点单倍型块和连锁不平衡

3.2.2 SSC15 上多态位点与猪产仔性能的相关性

4 小结

第三章 NRP2 CDNA 序列和组织表达以及高产仔分子机理的初步分析

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 组织样品

1.1.2 主要仪器设备

1.1.3 主要试剂及配制

1.1.4 主要分子生物学软件和网站

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA 提取、检测和浓度测定

1.2.2 总RNA 的反转录

1.2.3 猪NRP2 cDNA 电子克隆及与人鼠序列的比较

1.2.4 猪NRP2 mRNA 剪切形式的初步分析

1.2.5 荧光定量PCR 引物设计与合成

1.2.6 实时荧光定量PCR

1.2.7 实时荧光定量数据分析统计

2 结果与分析

2.1 总RNA 提取结果

2.2 猪NRP2 cDNA 电子克隆及与人鼠序列的比较

2.3 猪NRP2 mRNA 剪切形式的初步分析

2.4 14 个基因实时荧光定量结果及差异表达分析

2.4.1 定量PCR 的特异性

2.4.2 定量PCR 扩增曲线样本的重复性

2.4.3 基因表达定量结果

3 讨论

3.1 SYBR Green 荧光染料法定量PCR 的敏感性

3.2 猪NRP2 cDNA 的电子克隆及mRNA 的剪切形式

3.3 NRP2 组织特异性表达

3.4 二花脸和杜洛克14 个基因的表达差异

3.5 有待深入研究的几个问题

4 小结

致谢

参考文献

ABSTRACT

附录 1 文献综述

综述一猪基因组和功能基因研究进展

综述二放射杂交在猪基因组研究中的应用

综述三猪繁殖性状的 QTL 和候选基因研究进展

附录2 基因名英文全称

附录3 21 个基因片段的一致序列及结构

附录4 博士期间完成论文情况

发布时间: 2008-03-13

参考文献

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