论文摘要
旋毛虫病（trichinellosis）是由旋毛虫（Trichinella spiralis）引起的一类严重的人兽共患寄生虫病。目前用于本病免疫诊断的抗原多采用天然虫体抗原,如可溶性抗原、排泄分泌（ES）抗原等。虽然天然抗原诊断本病的敏感性较高,但天然抗原成分非常复杂,且常与其他寄生虫病出现交叉反应。并且至今无法实现旋毛虫的体外大量培养,且难以标准化生产。基因重组蛋白易于规模化生产,成分单一,因此具有广泛的应用前景。Ts21蛋白是近年来发现的旋毛虫ES抗原成分之一。本实验室克隆表达了旋毛虫（T.spiralis,T1）的Ts21蛋白。本研究对Ts21重组蛋白进行了进一步鉴定和亲和层析纯化,并对其免疫诊断价值与免疫预防作用进行了观察。材料与方法1.旋毛虫虫种与实验动物本实验所用虫种为旋毛虫（T1）、乡土旋毛虫（f2）、布氏旋毛虫（T3）、伪旋毛虫（T4）及纳氏旋毛虫（T7）。不同种旋毛虫感染小鼠血清为本实验室采集保存。旋毛虫病、棘球蚴病、囊尾蚴病、血吸虫病及并殖吸虫病患者血清均为来我室就诊后确诊的病人血清。4-6周龄雄性BALB/c与昆明小鼠购自郑州大学医学院实验动物中心,在本教研室动物饲养室饲养。2.Ts21重组蛋白的表达与纯化将构建好的原核表达载体和含有目的基因的重组质粒pMAL-c2X-Ts21用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,大量收集表达菌体超声破碎,用Amylose树脂预装柱进行亲和层析纯化。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,紫外分光光度法测定蛋白浓度。3.Ts21重组蛋白的进一步鉴定将纯化后的Ts21重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获得Ts21重组蛋白免疫小鼠血清,通过免疫印迹法（Western blot）鉴定免疫血清与Ts21重组蛋白、旋毛虫T1可溶性抗原与ES抗原的免疫反应性;取旋毛虫成囊前后,即感染后18d和42d的T1肌幼虫制作石蜡切片,通过免疫荧光抗体试验（IFA）检测小鼠抗Ts21重组蛋白血清与旋毛虫成囊前后幼虫的反应性。4.Ts21重组蛋白免疫诊断价值的研究将纯化的Ts21重组蛋白作为包被抗原,应用间接ELISA法检测感染不同种旋毛虫感染小鼠血清、旋毛虫病与其他寄生虫病人血清,观察300条T1肌幼虫感染小鼠后2～6w血清抗体水平的变化,并对低剂量（每只小鼠感染10条与5条T1肌幼虫）旋毛虫感染小鼠6w后的血清抗体进行了检测。5.Ts21重组蛋白免疫预防作用的研究60只小鼠随机分为3组（每组20只）:免疫组（A组）、佐剂组（B组）、空白对照组（C组）,免疫组应用Ts21重组蛋白（20μg/只小鼠）加入等量的弗氏完全佐剂（FCA）乳化后皮下注射,间隔10天免疫1次,共3次,第2、3次免疫用弗氏不完全佐剂（ICA）:末次免疫后10d,每只小鼠尾静脉采血,ELISA检测抗体水平。然后用300条T1肌幼虫攻击感染。佐剂组以同样体积的佐剂加等量的生理盐水,对照组仅注射等体积生理盐水,免疫和攻击感染方法同上。以上3组在攻击感染后84h和42d分别观察肠道成虫数和肌幼虫数,并计算减虫率。减虫率=（空白对照组虫数-试验组虫数）/空白对照组虫数×100%。6.ELISA应用Ts21重组蛋白与ES抗原分别建立Ts21-ELISA与ES-ELISA,2种抗原的包被浓度均为5μg/ml,包被后用2%BSA-PBST于37℃封闭2h,血清稀释度为1:100,每份样本加2孔,每孔100μl。结合物为羊抗小鼠IgG（1:6000）或羊抗人IgG（1:500）。底物为邻苯二胺（OPD）。每次试验时均设阳性、阴性及空白对照。终止反应后用酶标仪测定样品孔的吸光度(A492nm)值。以待测样本A值大于阴性对照A值2.1倍时为阳性。结果1.Ts21重组蛋白的特性Western blot发现,Ts21重组蛋白免疫小鼠血清只与T1肌幼虫可溶性抗原和ES抗原中Mr 21 000条带发生阳性反应,表明旋毛虫Ts21是T1肌幼虫可溶性抗原与ES抗原中的一部分。间接免疫荧光试验发现,Ts21重组蛋白免疫小鼠血清与旋毛虫成囊肌幼虫发生反应,在体壁上显示黄绿色荧光,而与18d的成囊前期幼虫不发生反应,提示Ts21重组蛋白的表达时期为成囊期幼虫。2.Ts21重组蛋白诊断旋毛虫病的敏感性与特异性应用Ts21-ELISA对T1、T2、T3、T4、T7感染小鼠血清检测时,抗体阳性率分别为86.0%（37/43）、16.7%（3/18）、7.1%（1/14）、36.4%（4/11）及36.4（4/11）;应用ES-ELISA检测T1、T2、T3、T4、T7感染小鼠血清的抗体阳性率分别为88.4%（38/43）、88.9%（16/18）、92.9%（13/14）、63.6%（7/11）、81.8%（9/11）。Ts21重组蛋白与ES抗原检测T1感染小鼠血清的敏感性无显著性差异（X2=0.104,P＞0.05）,但ES抗原与其他种旋毛虫感染小鼠血清的交叉反应率明显高于Ts21重组蛋白（X2=17.069,P＜0.05）。Ts21-ELISA检测旋毛虫病人的血清抗体阳性率为94.7%（18/19）,并殖吸虫病、棘球蚴病、囊尾蚴病及血吸虫病血清的交叉反应率分别为10.5%（3/19）、7.7%（1/13）、16.7%（1/6）、0%（0/4）;ES-ELISA检测旋毛虫病人的血清抗体阳性率为100%（19/19）、上述其他寄生虫病人血清的交叉反应率分别为10.5%（2/19）、23.1（3/19）、0%（0/6）、0%（0/4）。Ts21重组蛋白与ES抗原检测旋毛虫病患者血清的敏感性与特异性均无显著性差异（X2=0.000,P＞0.05;X2=0.010,P＞0.05）。3.Ts21重组蛋白对不同剂量旋毛虫感染小鼠后不同时间的检测300条T1肌幼虫感染10只小鼠后2w、3w,Ts21-ELISA阳性率分别为20%和60%,感染后4～6w阳性率均为100%;应用ES-ELISA检测时,感染后2w、3w的小鼠血清抗体阳性率分别为20%和40%,感染后4～6w的阳性率均为100%。Ts21-ELISA与ES-ELISA对10条T1肌幼虫感染的10只小鼠血清检测时,抗体阳性率分别为90%和100%（X2=0.000,P＞0.05）;两种抗原对5条T1肌幼虫感染的10只小鼠血清检测时,抗体阳性率均为100%。4.Ts21重组蛋白的免疫预防作用Ts21重组蛋白末次免疫小鼠后10d的血清抗体滴度为1:106。攻击感染后84h,免疫组、佐剂组及对照组的肠道成虫数分别为43.60±20.07、68.70±28.54及76.10±17.67,免疫组与佐剂组及对照组之间均有显著性差异（P＜0.05）,免疫组与佐剂组的成虫减虫率分别为42.71%和9.72%。攻击感染后42d,免疫组、佐剂组及对照组的肌幼虫数分别为16973.80±7111.06、32205.00±12145.33及33812.50±24703.42,免疫组与佐剂组及对照组之间均有显著性差异（P＜0.05）,免疫组与佐剂组的肌幼虫减虫率分别为49.80%和4.75%。结论1.旋毛虫Ts21蛋白是旋毛虫肌幼虫ES抗原的一部分,该蛋白在成囊期幼虫表达,但在成囊前期幼虫不表达。2.旋毛虫Ts21重组蛋白与ES抗原检测旋毛虫感染小鼠血清的敏感性相似,特异性优于ES抗原;两种抗原检测旋毛虫病患者血清的敏感性与特异性无显著性差异。Ts21重组蛋白可用于旋毛虫病的血清学诊断。3.旋毛虫Ts21重组蛋白具有一定的免疫保护作用。
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