犬干扰素-γ的复性及活性测定

论文摘要

犬干扰素是治疗犬病毒性疾病的一种有效手段，但以原核细胞表达的干扰素多以包涵体形成存在，为无生物学活性的蛋白质，需要经过体外重薪折叠复性后才能恢复为具有生物活性的干扰素。稀释复性是一种简单快捷的蛋白质复性方法，也是研究其他复性方法的基础。本实验对表达犬干扰素—γ的pJLA605-CaIFN-γ重组质粒原核表达系统进行诱导表达，对表达后的菌体经溶菌酶作用后，超声波破碎，获得富含重组犬干扰素-γ的包涵体，洗涤后再通过8mol／L尿素溶解，将溶解后的包涵体通过稀释复性法进行复性；探讨了不同折叠促进剂、加样方式、温度、pH值在稀释法复性条件下对重组犬γ-干扰素体外折叠的复性影响；采用MDCK—VSV系统，通过细胞病变（CPE）效应为基础的结晶紫染色法测定复性后重组犬干扰素-γ的活性，用考马斯亮蓝法测定复性后的犬γ-干扰素的浓度。结果表明，每升诱导后的菌体经8mol／L尿素溶解后，得到的包涵体总蛋白为285mg；利用0.5M精氨酸、0.5M盐酸胍、2.0M尿素均能有效抑制复性过程中蛋白质的聚集，其中0.5M精氨酸的效果最好。在4℃、pH值8.0、0.5M精氨酸复性液，蛋白浓度0.15mg·mL-1及脉冲加样操作方式下，复性后重组犬γ-干扰素的活性为1.35×104U·mL-1，比活达3.74×106U·mg-1。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 干扰素生物学特性研究进展
• 1.1.1 干扰素的产生与诱导
• 1.1.2 IFN-γ的分子结构与生物学作用
• 1.1.3 IFN抑制病毒复制的作用机理
• 1.1.4 IFN的应用和发展趋势
• 1.2 干扰素-Γ体外表达与复性
• 1.2.1 包涵体的性质
• 1.2.2 包涵体的形成
• 1.2.3 包涵体的分离
• 1.2.4 包涵体的溶解
• 1.2.5 蛋白质的复性机理
• 1.2.6 包涵体蛋白质体外折叠复性方法
• 1.2.7 重组干扰素-γ复性过程的检测方法
• 1.3 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 犬干扰素-γ活性测定的主要材料
• 2.1.3 蛋白浓度测定的主要试剂
• 2.1.4 包涵体的洗涤液和溶解液
• 2.1.5 包涵体复性主要试剂
• 2.1.6 细菌培养液
• 2.1.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）主要试剂
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 重组菌的诱导表达
• 2.3.2 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.3.4 包涵体的制备
• 2.3.5 包涵体的粗提
• 2.3.6 包涵体溶解蛋白的稀释复性
• 2.3.7 分析方法
• 2.3.8 结果计算
• 2.3.9 重组犬干扰素-γ活性测定
• 3 结果
• 3.1 细胞超声波破碎的适合的超声次数和功率
• 3.2 重组犬干扰素-Γ包涵体的洗涤和溶解
• 3.3 重组犬干扰素-Γ包涵体的稀释复性
• 3.3.1 折叠促进剂对犬干扰素-γ的复性影响及抗病毒活性
• 3.3.2 脉冲加样对重组犬干扰素-γ复性的影响
• 3.3.3 温度对重组犬干扰素-γ复性的影响
• 3.3.4 pH值对重组犬干扰素-γ包涵体变性蛋白复性的影响
• 3.3.5 NaCl浓度对重组犬干扰素-γ复性的影响
• 3.4 重组犬干扰素-Γ活力测定及计算
• 50测定结果'>3.4.1 VSV病毒TCID₅₀测定结果
• 3.4.2 BSA标准曲线的绘制
• 4 讨论
• 4.1 犬干扰素-Γ包涵体提取方法的优化
• 4.2 犬干扰素-Γ活力测定方法的建立
• 4.3 重组犬干扰素-Γ复性条件的探讨
• 4.4 复性折叠促进剂的选择
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文