促红细胞生成素对缺血导致视网膜神经节细胞损伤的保护作用及其机制

论文摘要

促红细胞生成素（EPO）传统上被认为是由胎儿肝脏和成人肾脏对缺血起反应的造血因子。近年研究结果证明,EPO在中枢神经系统有重要的生理作用。如EPO和EPO受体（EPO-Rs）在中枢神经系统内的表达,缺血、缺氧条件下EPO上调等说明,这一细胞因子是脑损伤反应的重要调制子。但EPO对缺血再灌注损伤的视网膜神经节细胞的保护作用尚未见报道。 本实验以视网膜电图为指标,从器官水平上观察到EPO有保护缺血再灌注损伤的视网膜功能。以对缺血、缺氧最易感的视网膜神经节细胞为观察对象,通过体外培养视网膜神经节细胞给予缺氧和兴奋性氨基酸谷氨酸处理,模拟体内缺血缺氧损伤条件,应用全细胞膜片钳技术,从细胞水平上观察到EPO可降低视网膜神经节细胞Ca2+通道电流,从分子水平表明其上的电压依赖性L-型钙电流,可以被谷氨酸受体阻断剂APV阻断。还观察到EPO可降低视网膜神经节细胞Na+通道电流的幅值,以及降低谷氨酸引起的自发放电增多和谷氨酸受体门控通道电流。利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察到谷氨酸和缺氧引起视网膜神经节细胞内游离Ca2+浓度增加,EPO处理后可以减轻视网膜神经节细胞内游离Ca2+浓度增加。上述实验结果提示,EPO对视网膜缺血再灌注损伤的保护作用机制之一是减轻视网膜神经节细胞免受缺血再灌注损伤引起的谷氨酸能受体过度激活,减少之后的自由基形成和细胞凋亡,减少钙离子内流等而影响RGCs的生物学功能,从而起到保护作用。进而提示,EPO通过减少谷氨酸诱发视网膜神经节细胞钙超载后的细胞死亡,抑制自发放电和钠离子流,降低视网膜神经节细胞的膜兴奋性,也起到保护作用。 进一步的体内实验,通过视网膜平铺技术观察视网膜神经节细胞计数,TUNEL法联合免疫组化,观察凋亡调控基因bax、bcl-2、caspase-3

论文目录

• 作者简介及学术成果
• 第一章 引言
• 第二章 文献综述
• 一、Epo与中枢神经系统
• （一） Epo的分子生物学
• （二） Epo在神经发育中的作用
• （三） Epo和 EpoR在中枢神经系统
• （四） Epo在神经系统和视网膜的作用
• （五） EPo介导的神经保护作用机制和信号传导通路
• 二、视网膜神经节细胞的损伤机制
• 三、视网膜神经节细胞（RGCs）的保护
• 四、视网膜缺血/再灌注模型的损伤机制
• 第三章 Epo对缺血再灌损伤视网膜神经节细胞的影响
• 第一节 Epo对缺血视网膜神经节细胞离子通道的影响
• 一、实验动物
• 二、主要仪器
• 三、药品与试剂
• 四、实验方法
• （一） 所需溶液配制
• （二） 视网膜神经节细胞的培养
• （三） 膜片钳实验装置
• （四） 全细胞膜片钳实验方法
• （五） 实验分组
• （六） 实验数据的采集和处理
• （七） 统计学方法
• 五、实验结果
• （一） RGCs鉴定结果
• （二） RGCs钙通道电流的特性
• Ca)的特性'>（三） 缺氧RGCs钙通道电流(I_Ca)的特性
• （四） 不同浓度EPO对缺氧RGCs钙通道电流的阻断作用
• （五） EPO降低谷氨酸引起的RGCs自发放电增多
• Ca)'>（六） EPO降低RGCs谷氨酸门控离子电流(I_Ca)
• （七） 不同浓度EPO对缺氧RGCs钠通道电流的阻断作用
• 2+浓度的测定'>第二节 Fluo-3-AM荧光染色视网膜神经节细胞游离Ca²⁺浓度的测定
• 一、原理
• 二、实验方法
• 三、实验结果
• 第三节 EPO对缺血再灌注损伤视网膜神经节细胞的影响
• 一、实验动物
• 二、主要仪器
• 三、药品与试剂
• 四、实验方法
• （一） 视网膜缺血再灌注模型的建立
• （二） 实验分组
• （三） 给药方法
• （四） 视网膜电图（electroretinography ERG）的测定
• （五） 标本的取材、固定
• （六） 视网膜铺片技术和视网膜神经节细胞计数方法
• （七） TUNEL染色
• （八） 免疫组织化学染色
• （九） RT-PCR对bcl-2、caspase-3的半定量测定
• （十） Western Blot对bcl-2、Caspase-3蛋白表达量的测定
• （十一） 结果观察及数据处理
• （十二） 统计学分析
• 五、实验结果
• （一） ERG测定结果
• （二） 视网膜平铺技术的视网膜神经节细胞计数
• （三） 原位凋亡细胞检测结果
• （四） 免疫组织化学染色结果
• （五） RT-PCR测定结果
• （六） Western Blotting测定结果
• 第四章 讨论
• 一、EPO的神经保护作用
• 二、EPO通过减少凋亡和维持完整细胞数量，达到保护受损伤大鼠的视网膜神经节细胞
• 三、细胞凋亡
• （一） 概念
• （二） 诱发细胞凋亡过程的关键因子
• （三） 细胞凋亡的过程及机理
• （四） 细胞凋亡的形态特征
• （五） 线粒体在细胞凋亡中的重要性
• 第五章 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢