维生素A缺乏对神经精神系统影响的蛋白质组学研究

论文摘要

维生素A是一种多效的微量营养元素,维生素A对于早期神经系统发育和成年神经再生有重要的调节作用。成年维生素A缺乏的啮齿类动物表现出运动能力和学习记忆功能的异常。一些研究表明维生素A通路与精神分裂症有潜在的联系:维生素A通路调控许多精神分裂症候选基因的表达;精神分裂症病人血浆和脑脊液中维生素A转运蛋白TTR和APOE含量异常;精神分裂症脑组织中维生素A转运与合成相关分子表达异常。此外维生素A通路还与阿尔茨海默症（AD）有关。维生素A可以调控淀粉样前体蛋白（APP）基因,以及APP水解酶的表达;维生素A缺乏动物表现出一些AD相关的分子变化:淀粉样蛋白聚集,胆碱乙酰转移酶和视黄酸受体RARα的下调。在本研究的第一部分工作中,我们检测了早期维生素A缺乏（VAD）小鼠的运动能力、长期记忆能力和热痛刺激的敏感性,并检测了早期VAD和谷氨酸受体拮抗剂MK-801（5-甲基二氢丙环庚烯亚胺马来酸）的双重作用对小鼠行为的影响。我们发现早期VAD小鼠展现出更高的旷场移动和旷场直立能力,以及热痛敏感性的增加;早期VAD小鼠对MK-801的注射更敏感:增加了MK-801诱导的刻板行为和共济失调行为,增加了MK-801对旷场直立的抑制作用,MK-801和维生素A缺乏的交互作用导致热痛不敏感。这些行为学的异常反映了某些类似精神分裂症的行为,如旷场行为增加和MK-801诱导的刻板行为增加。然而我们并没有发现早期VAD对长期恐惧记忆（步下法实验）的影响。此后我们利用蛋白质组学技术研究了早期VAD雄性小鼠海马、皮层和肝脏组织的蛋白质水平差异。我们还研究了神经胶质瘤细胞U251中维生素A活性形式视黄酸的合成抑制对蛋白质组的影响。我们鉴定了海马中23个VAD相关蛋白点,皮层中46个差异蛋白点,肝脏中38个差异蛋白点和U251细胞39个差异蛋白点。通过生物信息学分析（Ingenuity pathway analysis）,我们发现VAD皮层和神经胶质细胞中的差异蛋白汇聚在氧化压力反应,神经递质代谢（丝氨酸和谷氨酸）,线粒体功能和能量代谢异常（ATP合成）; VAD在皮层中可能通过影响谷氨酸NMDA受体2B、细胞骨架和调控转录因子,来改变神经细胞的迁移、生长、发育和神经突触的可塑性。其中3磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）在视黄酸合成抑制的U251细胞中显著上调得到了Western blot的验证,而PHGDH同样在VAD皮层中显著上调。在VAD雄性小鼠海马中差异蛋白汇聚在脂代谢、神经轴突生长和突触塑形性等功能。VAD可能通过调节细胞骨架和细胞膜相关蛋白来影响神经递质的释放,多巴胺信号通路,谷氨酸NMDA受体2B介导的通路,以及神经细胞的再生和迁移。在肝脏组织中,维生素A缺乏可以造成糖代谢和脂代谢的异常,这同我们在皮层中的发现是一致的。因此我们认为早期VAD可能影响皮层和海马能量代谢和细胞骨架,影响谷氨酸通路和多巴胺通路,从而造成小鼠的类精神分裂症行为（旷场行为增加,MK-801诱导的刻板行为增加）。这些结果进一步支持维生素A缺乏与神经精神疾病有关的假说。SynapsinⅡ是一种神经元磷酸化蛋白,位于神经突触囊泡,与细胞骨架相连,参与调节神经递质的释放。有一些报道提示SynapsinⅡ与精神分裂症有关:精神分裂症病人海马与皮层中Synapsin II mRNA与蛋白含量降低;关联分析表明Synapsin II与精神分裂症显著相关（汉族人群,韩国人群,北欧人）;此外Synapsin II基因敲除小鼠表现出类精神分裂症的行为异常:感觉门控,社交退缩。SynapsinⅡ由2种剪切异形体:SynapsinⅡa和SynapsinⅡb。以往的研究表明在双向凝胶上每种SynapsinⅡ剪切异形体均表现出多个翻译后修饰亚型。然而目前对于SynapsinⅡ翻译后修饰的信息了解甚少。在本研究的第二部分工作中,我们利用多种蛋白酶水解和串联质谱技术（LC-ESI-QTOF, LC-ESI-TRAP）,研究了大鼠和小鼠海马组织中SynapsinIIa和SynapsinIIb的蛋白序列以及翻译后修饰信息。我们总共鉴定了12个小鼠海马SynapsinII蛋白点（6个IIa蛋白点,6个IIb蛋白点）和13个大鼠海马SynapsinII蛋白点（6个IIa蛋白点,7个IIb蛋白点）,其中18个蛋白点得到90%以上的串联质谱序列覆盖率。我们提供了每个SynapsinII剪切体翻译后修饰蛋白点的全面翻译后修饰信息（包括磷酸化,甲基化,乙酰化,脱氨基化等）。我们还发现了7个新的磷酸化位点,其中3个经过磷酸酶处理得到验证（大鼠SynapsinIIa的T422,SynapsinIIb的S426和T338）,其他4个为大鼠SynapsinIIa的S546、SynapsinIIb的T422和S446,以及小鼠SynapsinIIa的S446。我们在SynapsinIIb中发现了N339的糖基化修饰。这些翻译后修饰信息对于今后系统研究SynapsinII在调节神经递质释放中的机制有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 综述
• 第一章 维生素A 与神经精神系统
• 第一节 维生素A 概述
• 第二节 维生素A 对神经系统的影响
• 第三节 维生素A 与神经精神疾病的关系
• 第二章 蛋白质组学技术
• 第一节 蛋白质组学概述
• 第二节 蛋白质组学技术
• 第三章 SYNAPSIN 蛋白家族与精神分裂症
• 第一节 Synapsin 蛋白家族概述
• 第二节 SynapsinⅡ蛋白质功能
• 第三节 SynapsinⅡ与精神分裂症
• 第二篇 实验部分
• 第一章 维生素A 缺乏的蛋白质组学研究
• 前言
• 第一节 早期维生素A 缺乏小鼠的行为学研究
• 第二节 早期维生素A 缺乏小鼠组织的蛋白质组学研究
• 第三节 视黄酸合成抑制对神经胶质细胞的影响
• 第四节 讨论
• 第二章 SYNAPSINⅡ异形体的质谱研究
• 第一节 前言
• 第二节 材料与方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论
• 第三篇 总结与展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表和待发表的论文目录