1，3-丙二醇发酵工艺优化

论文摘要

1,3-丙二醇（1，3-PDO）是一种重要的化工原料,在聚酯合成领域有很好的应用前景,其生物生产方法已经引起了广泛的重视。本实验主要从事了两方面的工作：一、对野生克雷伯肺炎杆菌生产1,3-丙二醇的发酵工艺进行了优化。通过优化发酵过程中的甘油浓度,降低了底物抑制。采用优化后的批式补料发酵,1,3-丙二醇浓度（62.03g·L-1）、甘油转化率（0.52m01·mol-1）和生产强度（1.94g·（L·h）-1）,与之前的发酵情况相比分别提高了44.3%、4%和179.6%。为了降低发酵成本,找到了廉价的替代氮源发酵用大豆蛋白粉。建立了一种中间代谢物反馈即时控制底物浓度生产1,3-丙二醇的方法,克服了补料时所具有的延迟性、盲日性等缺点。利用中间代谢物中和剂消耗量和底物（葡萄糖、甘油）消耗量之间的函数关系来反馈控制补料,实现了发酵过程不需要测量底物浓度来实现底物（葡萄糖、甘油）浓度的即时控制,简化了底物浓度的控制方法。二、对构建的重组克雷伯肺炎杆菌进行了初步发酵。对重组克雷伯肺炎杆菌进行了发酵工艺优化,采用微氧发酵,转化率比厌氧时稍微降低,但1,3-丙二醇浓度和生产强度有所提高。使用紫外线一氯化锂复合诱变联合菌种驯化的传统方法,对之前构建的重组克雷伯肺炎杆菌进行了育种与筛选工作,获得了可耐受较高1,3-丙二醇浓度（95g·L-1）的优良突变菌株,通过摇瓶筛选及批式补料实验,确定了一株高产菌M-5。与诱变驯化前相比,1,3-丙二醇产量提高了24%,乙酸产量也有相应的提高,而乙醇产量有所降低。在微氧条件下以葡萄糖为辅助碳源进行发酵,发酵初始和补料均添加葡萄糖时,30L发酵罐中诱变后的重组菌的1,3-丙二醇浓度、甘油转化率和生产强度分别为87.1g·L-10.65mol·mol-1，2.9g·（L·h）-1;比野生菌株分别提高了40.4%,25%,49.5%；150L发酵罐中试实验中1,3-丙二醇浓度、甘油转化率和生产强度分别为83.8g·L-1,0.65mol·mor-1,2.79g·（L·h）-1。产量基本稳定,为以后的中试及工业化生产奠定了基础。

论文目录

• 学位论文数据集
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 1,3-丙二醇概况
• 1.1.1 1,3-丙二醇的理化性质
• 1.1.2 1,3-丙二醇的用途
• 1.1.3 1,3-丙二醇的生产方法
• 1.2 微生物发酵生产1,3-丙二醇
• 1.2.1 产生1,3-丙二醇的微生物
• 1.2.2 1,3-丙二醇的代谢途径
• 1.2.3 1,3-丙二醇代谢中的关键酶及基因
• 1.2.3.1 甘油脱水酶（GDHt）
• 1.2.3.2 甘油脱水酶再激活酶
• 1.2.3.3 1,3-丙二醇氧化还原酶（PDOR）
• 1.2.3.4 1,3-丙二醇氧化还原酶的同功酶
• 1.2.3.5 甘油脱氢酶（GDH）
• 1.2.3.6 二羟基丙酮激酶（DHAK）
• 1.2.4 1,3-丙二醇的发酵过程的研究与开发
• 1.2.4.1 菌株选择
• 1.2.4.2 产1,3-丙二醇基因工程菌的研究
• 1.2.4.3 底物和产物耐受型菌株的筛选
• 1.2.4.4 发酵工艺的研究
• 1.2.4.5 产物和代谢中间产物对1,3-丙二醇发酵的影响
• 1.2.4.6 发酵过程的动力学研究
• 1.2.4.7 代谢网络工程的研究
• 1.3 存在的问题及展望
• 1.4 本课题的研究意义和立题依据
• 第二章 野生克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇发酵工艺优化
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 试验试剂及仪器设备
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 发酵条件和培养方法
• 2.2.5 发酵参数分析
• 2.2.5.1 生物量的测定
• 2.2.5.2 底物和产物的测定
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 甘油浓度对发酵的影响
• 2.3.2 多种廉价氮源的研究
• 2.3.3 一种中间代谢物反馈即时控制底物浓度生产1,3-丙二醇的方法
• 2.4 小结
• 第三章 重组克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇发酵工艺优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 试验试剂及仪器设备
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 实验方法
• 3.2.5 紫外诱变
• 3.2.6 菌种驯化
• 3.2.7 发酵参数分析
• 3.2.7.1 生物量的测定
• 3.2.7.2 底物和产物的测定
• 3.2.7.3 1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶的活性测定
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 诱变驯化
• 3.3.1.1 紫外线、氯化锂复合诱变驯化
• 3.3.1.2 氮离子注入诱变驯化
• 3.3.2 批式连续发酵过程中氮源的优化
• 3.3.2.1 批式连续发酵过程中氮源用量的优化
• 3.3.2.2 关于廉价氮源的研究
• 3.3.2.3 无机氮源的选择优化
• 3.3.3 辅助碳源的优化
• 3.3.3.1 辅助碳源的选择
• 3.3.3.2 底物中葡萄糖浓度的优化
• 3.3.3.3 补料中葡萄糖浓度的优化
• 3.3.4 发酵过程中的酶活变化
• 3.3.5 富马酸发酵液的利用
• 3.3.6 乙酸对发酵过程的影响
• 3.3.7 甘油流加方式的优化
• 3.3.8 有关生物柴油废甘油利用的相关研究
• 3.3.8.1 废甘油预处理
• 3.3.8.2 摇瓶实验
• 3.3.8.3 批式连续发酵实验
• 3.3.8.4 废甘油中主要组分对发酵的影响
• 3.3.9 碳酸钙调节pH值的初步尝试
• 3.3.10 有关基因敲除重组Klebsiella pneumoniae发酵的研究
• 3.3.10.1 乙醇基因敲除重组Klebsiella pneumoniae的批式发酵实验
• 3.3.10.2 2,3-丁二醇基因敲除重组Klebsiella pneumoniae的批式发酵实验
• 3.3.11 发酵工艺的中试放大
• 3.4 小结
• 第四章 结论
• 第五章 问题与建议
• 参考文献
• 附录1 试剂
• 附录2 仪器与设备
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者和导师简介
• 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书