TRPC3、TRPC6通道对颞叶癫痫小鼠痫性发作及海马神经元可塑性的调控

论文摘要

第一章匹罗卡品致颞叶癫痫小鼠模型的建立及评价目的：评价匹罗卡品致颞叶癫痫模型在C57BL/6小鼠中的应用,探讨建立该模型的优化方案。方法：将6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组。实验组采用匹罗卡品腹腔注射法诱导癫痫持续状态（SE）,对照组腹腔注射等量无菌生理盐水。根据SE诱发成功与否,进一步将实验组分为SE组及未达SE组。SE后连续50天观察小鼠行为学表现并记录自发性痫性发作（SS）。SE后第50天行：①Nissl染色观察海马病理改变并对海马各区神经元计数；②Timm染色观察海马苔藓纤维出芽并评分。结果：1.实验组造模成功率为40%,死亡率为47.5%。2.模型小鼠慢性期SS发生率为87.5%,平均潜伏期为12.8±8.7天。SS频率为1.41±1.13次/周,多在昼夜交替时出现。一次SS持续时间常为10～40秒,一般不超过1分钟。此外,SS还具有簇发性的特点。3.SE组小鼠海马可见CA区和门区神经元较对照组显著减少（P<0.01）,齿状回区受累不明显,较少见颗粒细胞的缺失。未达SE组小鼠海马各区细胞形态基本完整,排列规整,神经元计数较对照组无明显差异。4.SE组小鼠均可见齿状回内分子层（IML）显著出芽,部分小鼠可见CA3区点状Timm颗粒,Timm染色评分显著高于对照组（IML,P<0.01；CA3,P<0.05）。未达SE组Timm染色评分与对照组无显著差异。结论：建立在C57BL/6小鼠上的匹罗卡品模型是一种理想的颞叶癫痫模型。第二章TRPC3、TRPC6通道对颞叶癫痫小鼠痫性发作的调控目的：探讨TRPC3、TRPC6通道对匹罗卡品急性诱导的痫性发作及慢性期自发性痫性发作的影响。方法：将30只6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分为TRPC3干预组、TRPC6干预组及空白对照组,分别予侧脑室注射anti-TRPC3、anti-TRPC6及无菌生理盐水。术后5小时行癫痫敏感性测定：腹腔注射匹罗卡品后连续2小时观察动物行为学变化并记录第一次3级发作的出现时间、各级别发作所占比例及死亡率。采用免疫组化法检测TRPC3、TRPC6通道蛋白在SE后各时间点海马各区的表达变化。另选18只匹罗卡品致SE后存活的C57BL/6小鼠,随机分为TRPC3干预组、TRPC6干预组及空白对照组,于SE后1d、15d两个时间点分别予侧脑室注射anti-TRPC3、anti-TRPC6及无菌生理盐水,连续60天观察小鼠的行为学表现并记录自发性痫性发作。结果：1.癫痫敏感性测定结果显示：TRPC3干预组及TRPC6干预组出现第一次3级发作的平均时间分别为63.4±43.5 min及53.8±40.4min,均较空白对照组（15.0±9.24 min）显著延长。空白对照组5级以上发作达50%,而TRPC3干预组及TRPC6干预组5级以上发作分别仅占20%及18%。2小时内三组的死亡率分别为10%（TRPC3干预组）,20%（TRPC6干预组）及20%（空白对照组）。2.免疫组化结果显示：TRPC3通道蛋白在SE后各时间点的表达水平与正常对照组相比无显著性差异。而CA3区TRPC6通道蛋白的表达水平在SE后2h即较对照显著升高（p<0.01）,SE后1d、15d两次达峰值（p<0.01）,其余时间点维持高表达（SE 7d, p<0.05; SE 60d, p<0.01）,海马其他各区各时间点TRPC6通道蛋白的表达除CA1区15d较对照升高外（p<0.01）,余无明显差异。3.慢性期行为学观察结果显示：TRPC6干预组小鼠60天观察期内的自发发作总次数（3.83±1.47）显著低于空白对照组（6.83±2.31）及TRPC3干预组（6.00±2.00）（p<0.05）。三组潜伏期分别为19.8±8.98天、13.3±4.84天、14.1±4.12天,无显著性差异。结论：1.TRPC3. TRPC6通道可能介导匹罗卡品诱导的急性痫性发作。2.TRPC6通道可能与颞叶癫痫小鼠自发性痫性发作的严重程度有关。第三章TRPC3、TRPC6通道对颞叶癫痫小鼠海马神经元可塑性的调控目的：探讨颞叶癫痫小鼠海马神经元可塑性的改变及TRPC3、TRPC6通道对其的影响。方法：将匹罗卡品致SE后存活的6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分为TRPC3干预组（n=12）、TRPC6干预组（n=12）以及空白对照组（n=12）,于SE后1d、15d两个时间点分别予侧脑室注射anti-TRPC3、anti-TRPC6及无菌生理盐水,SE后60天处死行Timm染色并评分,行Golgi染色计算各组海马齿状回颗粒细胞及CA3区锥体细胞树突分支节点数及树突棘密度。正常对照组（n=12）：采用无菌生理盐水替代匹罗卡品及侧脑室注射药物,余处理同实验组。结果：1.Timm染色结果显示：空白对照组、TRPC6干预组及TRPC3干预组小鼠海马均可见齿状回内分子层显著出芽及CA3区点状Timm颗粒。Timm评分三组间无明显差异,但均较正常对照组显著升高（p<0.01）。2.Golgi染色结果显示：空白对照组、TRPC6干预组、TRPC3干预组及正常对照组颗粒细胞树突分支节点数及树突棘密度无明显差异。CA3区锥体细胞树突分支节点数空白对照组较正常对照组有所上升,但无统计学意义,TRPC6干预组较空白对照组及TRPC3干预组显著降低（p<0.05）。各组之间CA3区锥体细胞1级树突的树突棘密度无明显差异。TRPC6干预组2级树突的树突棘密度较空白对照组及TRPC3干预组均显著降低（p<0.05）,3级树突的树突棘密度也明显低于后两组,但无统计学意义。结论：TRPC6通道可能参与颞叶癫痫海马神经元可塑性的调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 匹罗卡品致颞叶癫痫小鼠模型的建立及评价
• 1.1 前言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 结论
• 第二章 TRPC3、TRPC6通道对颞叶癫痫小鼠痫性发作的调控
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第三章 TRPC3、TRPC6通道对颞叶癫痫小鼠海马神经元可塑性的调控
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文