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环境中雌二醇等微量荷尔蒙物质的免疫分析、化学发光分析研究

2020-11-22阅读(233)

环境中雌二醇等微量荷尔蒙物质的免疫分析、化学发光分析研究

论文摘要

环境荷尔蒙的污染问题已成为全球环境问题之一，已引起世界各国极大地关注。近年来环境荷尔蒙的分析监测方法研究主要有气相色谱-质谱（GC-MS）、液相色谱-质谱（LC-MS）、免疫分析。尽管色谱分析提供了高灵敏的检测手段，然而色谱分析方法，不但仪器昂贵，而且须进行繁杂的前处理，如加标、萃取、净化、浓缩等，一般分析一组试样要花费较长的时间，且分析的费用也较大，不便于推广应用。由于免疫分析的高特异性和操作简便、方便、经济，近年来在环境荷尔蒙分析检测中的研究成为了研究的热点。同时流动注射化学发光分析方法具有灵敏、准确、重现性好和便于自动化等优点，已在药物、环境分析中得到高度重视。本文从半抗原的改造、修饰到完全抗原的制备，免疫动物产生抗体，建立免疫分析方法为主展开工作，对雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A等环境荷尔蒙进行了分析方法研究，以便为环境荷尔蒙的研究提供更加灵敏、简便、快速的检测手段。主要内容如下：1．对雌二醇进行了修饰，引入了连接臂，并与牛血清蛋白结合，合成了完全抗原，测定了抗原中雌二醇与蛋白质的结合比为25：1。利用制备的完全抗原免疫大耳白家兔，制备了抗雌二醇多克隆抗体，ELISA测得抗血清的中点效价为1：25000，抗血清与雌酮的交叉反应率为5％，与雌三醇的交叉反应率为2％，与孕酮的交叉反应率为＜0.1％。抗体的特异性较高。2．将生物素-亲合素放大系统引入酶免疫分析中，以辣根过氧化物酶标记的亲合素作为探针，邻苯二胺作为辣根过氧化物酶的底物，建立了一种测定雌二醇的电化学酶免疫分析新方法，方法测定雌二醇的线性范围为50.0-500.0 pg．mL-1，检出限为21.0 pg．mL-1。与传统的光度检测的ELISA相比，该方法灵敏度高、检出限低两个数量级。并应用于环境水中雌二醇的测定，结果满意。3．将高灵敏的流动注射-化学发光分析技术与特异性的免疫分析结合，并采用样品与酶标抗体预温育免疫反应后采样注入免疫反应柱，建立了测定雌二醇的流动注射化学发光免疫分析新方法。方法的线性范围为10.0-1000.0 ng．mL-1，检出限为3.0 ng．mL-1。除预温育时间外测量时间为400s。方法应用于鸡粪及血清样品的分析，结果满意。4．对雌三醇半抗原进行了修饰，引入了连接臂，并与牛血清蛋白结合，形成了完全抗原，测定了抗原中雌三醇与蛋白质的结合比。利用制备的抗原免疫大耳白家兔，制备了抗雌三醇抗体，ELISA测得抗血清的中点效价为1：21000，抗血清与17β雌二醇的交叉反应率为2.5％，与雌酮的交叉反应率为0.5％，与孕酮的交叉反应率为0.2％。抗体特异性良好。5．提出了一种新的辣根过氧化物酶的底物-甲基红，建立了甲基红-H2O2-HRP电化学免疫分析新体系，并应用于雌三醇的测定。甲基红本身具有电化学活性，能够在静汞电极上发生还原反应，产生灵敏的伏安电流信号。以H2O2为氧化剂，HRP能催化氧化还原反应的发生，使甲基红被氧化分解，其平衡浓度降低，对应的还原峰电流降低，峰电流的降低值与HRP的浓度在50.0-500.0ng．mL-1之间呈线性关系，对200.0 ng．mL-1HRP进行11次测定的相对标准偏差为3.3％，方法的检出限为18.0 ng．mL-1。测定雌三醇的线性范围为1.0-1000.0 ng．mL-1，检出限为0.33 ng．mL-1。应用于血清及河底泥中雌三醇的测定，结果满意。6．以琼脂糖凝胶为载体，制备了免疫反应柱，并采用样品与酶标记抗体预温育免疫反应后注样模式，建立了测定雌三醇的流动注射化学发光免疫分析新方法，方法的线性范围为10.0-400.0 ng mL-1，检出限为5.0 ng mL-1。除预温育时间外测量时间为400s。方法应用于血清及孕妇尿液样品的分析，结果满意。7．合成了己烯雌酚单羧甲基醚，并合成了己烯雌酚完全抗原--己烯雌酚-牛血清蛋白。对家兔进行免疫制备了抗己烯雌酚抗体。测定了抗血清的中点效价为1：11000。以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为探针，邻苯二胺作为辣根过氧化物酶的底物，自制抗己烯雌酚抗体为免疫反应试剂，建立了一种测定己烯雌酚的电化学酶免疫分析新方法，方法测定己烯雌酚的线性范围为1.0-500.0ng．mL-1，检出限为0.4 ng．mL-1。并应用于动物饲料及血清中己烯雌酚的测定，结果满意。8．基于在碱性介质中，己烯雌酚对N-溴代丁二酰亚胺-鲁米诺化学发光体系的阻抑作用，建立了测定己烯雌酚的流动注射-化学发光分析新方法，探讨并优化了流动注射化学发光的分析条件。该方法测定己烯雌酚的线性范围为15.0-260.0 ng．mL-1，检出限为5.0 ng．mL-1，对100.0 ng．mL-1的己烯雌酚标准溶液进行11次测定，相对标准偏差为2.6％。并应用于饲料、己烯雌酚片剂样品中的己烯雌酚含量进行了测定，结果满意。9．以4，4-二苯基羟基戊酸为基础，制备了用于免疫的双酚A完全抗原--4，4-二苯基羟基戊酸-牛血清蛋白。并免疫大耳白家兔制备了抗双酚A的抗体，抗血清的中点效价为1：10000；抗血清与4，4-二苯基羟基戊酸的交叉反应率为150％，与双酚A的交叉反应率为100％，与对苯二酚的交叉反应率为8％，与雌二醇的交叉反应率为＜1％，与雌三醇的交叉反应率为＜1％，与苯酚的交叉反应率为＜1％。利用该抗体建立了测定双酚A的电化学免疫分析方法，测定的线性范围为2.0-1000.0 ng．mL-1。检出限为0.5 ng．mL-1。应用于水样及血清样品中双酚A的测定，结果满意。10．基于双酚A对鲁米诺．铁氰化钾化学发光反应体系的化学发光的抑制作用，建立了一种测定环境雌激素双酚A的流动注射化学发光分析新方法。双酚A的浓度在182.4-2736.0 ng．mL-1。范围内与△Ⅰ呈良好的线性关系，检出限为70.7ng．mL-1，方法应用于聚碳酸酯塑料水溶出液中双酚A的测定，结果满意。11．将免疫分析和化学发光分析结合，以辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体为探针，四苯硼钠增强的鲁米诺-过氧化氢化学发光体系为基础，建立了增强化学发光酶免疫分析法测定双酚A的新方法。在25.0-1000.0 ng．mL-1范围内，双酚A的浓度与化学发光强度呈良好的线性关系，检出限为5.0 ng．mL-1。并应用于水样中双酚A的测定，结果满意。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 环境荷尔蒙概述
  • 1.1.1 环境荷尔蒙概念的产生
  • 1.1.2 环境荷尔蒙问题大事年表
  • 1.1.3 环境荷尔蒙的危害
  • 1.1.4 环境荷尔蒙的作用机制
  • 1.1.5 环境荷尔蒙的种类
  • 1.1.6 我国对环境荷尔蒙问题研究的重视
  • 1.2 目前环境荷尔蒙分析研究的现状及分析检测的发展方向
  • 1.2.1 环境荷尔蒙的分析检测现状
  • 1.2.2 环境荷尔蒙监测分析的发展方向
  • 1.3 免疫分析基础
  • 1.3.1 免疫分析概述
  • 1.3.1.1 抗体抗原反应特性
  • 1.3.1.2 抗体作为分析试剂
  • 1.3.1.3 常用的标记免疫分析原理
  • 1.3.2 免疫分析检测方法
  • 1.3.3 展望
  • 1.4 本课题的主要研究内容
  • 1.5 参考文献
  • 第二章 雌二醇完全抗原的合成、抗体的制备
  • 2.1 引言
  • 2.2 实验部分
  • 2.2.1 仪器与试剂
  • 2.2.2 雌二醇半抗原的修饰及完全抗原的制备
  • 2.2.3 雌二醇半抗原衍生物的鉴定
  • 2.2.4 雌二醇半抗原与蛋白质偶联结合物的鉴定
  • 2.2.5 免疫动物实验
  • 2.2.6 抗血清效价的测定
  • 2.2.7 抗血清的特异性测定
  • 2.2.8 抗血清的纯化
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 雌二醇-3-羧甲基醚的制备
  • 2.3.2 雌二醇-3-羧甲基醚的鉴定
  • 2.3.3 雌二醇-3-羧甲基醚-BSA的制备
  • 2.3.4 雌二醇-3-羧甲基醚-BSA结合物的结合比测定
  • 2.3.5 免疫动物及抗血清效价的测定
  • 2.3.6 抗血清的特异性
  • 2.3.7 抗体的纯化与保存
  • 2.4 小结
  • 2.5 参考文献
  • 第三章 利用生物素-亲合素放大系统电化学酶联免疫分析测定水中雌二醇
  • 3.1 引言
  • 3.2 实验部分
  • 3.2.1 仪器与试剂
  • 3.2.2 缓冲溶液
  • 3.2.3 抗体的制备
  • 3.2.4 包被原的制备
  • 3.2.5 生物素化抗体的制备
  • 2O2-HRP伏安分析方法'>3.2.6 邻苯二胺（OPD）-H2O2-HRP伏安分析方法
  • 3.2.7 ECIA测量步骤
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 邻苯二胺的电化学特性
  • 3.3.2 酶催化反应条件及伏安测量条件
  • 3.3.3 免疫反应条件
  • 3.3.4 免疫测量模式及工作曲线
  • 3.3.5 样品分析
  • 3.4 小结
  • 3.5 参考文献
  • 第四章 利用免疫反应柱流动注射化学发光免疫分析法测定雌二醇
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验部分
  • 4.2.1 试剂
  • 4.2.2 缓冲溶液
  • 4.2.3 抗体的制备
  • 4.2.4 辣根过氧化物酶标记抗体
  • 4.2.5 免疫柱的制备
  • 4.2.6 仪器与操作步骤
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 免疫反应模式
  • 4.3.2 流动注射化学发光测量条件
  • 4.3.3 免疫反应条件
  • 4.3.4 免疫柱的稳定性
  • 4.3.5 测定雌二醇的工作曲线
  • 4.3.6 应用
  • 4.4 小结
  • 4.5 参考文献
  • 第五章 雌三醇人工抗原的合成、抗体的制备
  • 5.1 引言
  • 5.2 实验部分
  • 5.2.1 仪器与试剂
  • 5.2.2 雌三醇半抗原的修饰及完全抗原的制备
  • 5.2.3 雌三醇半抗原衍生物的鉴定
  • 5.2.4 雌三醇半抗原与蛋白质偶联结合物的鉴定
  • 5.2.5 免疫动物实验
  • 5.2.6 抗血清效价的测定
  • 5.2.7 抗血清的特异性测定
  • 5.2.8 抗血清的纯化
  • 5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 雌三醇-3-羧甲基醚的制备
  • 5.3.2 雌三醇-3-羧甲基醚的鉴定
  • 5.3.3 雌三醇-3-羧甲基醚-BSA的制备
  • 5.3.4 雌三醇-3-羧甲基醚-BSA结合物的结合比测定
  • 5.3.5 免疫动物及抗血清效价的测定
  • 5.3.6 抗血清的特异性
  • 5.3.7 抗体的纯化与保存
  • 5.4 小结
  • 5.5 参考文献
  • 2O2-HRP伏安酶联免疫分析法测定雌三醇'>第六章 甲基红-H2O2-HRP伏安酶联免疫分析法测定雌三醇
  • 6.1 引言
  • 6.2 实验部分
  • 6.2.1 仪器与试剂
  • 6.2.2 抗体的制备
  • 2O2-HRP伏安分析体系的建立'>6.2.3 甲基红（MR）-H2O2-HRP伏安分析体系的建立
  • 6.2.4 雌三醇的电化学免疫分析测定
  • 6.3 结果与讨论
  • 6.3.1 甲基红的电化学特性
  • 6.3.2 辣根过氧化物酶催化反应条件
  • 6.3.3 HRP的测定
  • 6.3.4 伏安酶联免疫分析测定雌三醇的条件
  • 6.3.5 测定雌三醇的工作曲线
  • 6.3.6 回收率实验
  • 6.3.7 样品测定
  • 6.4 小结
  • 6.5 参考文献
  • 第七章 流动注射化学发光免疫分析法测定雌三醇
  • 7.1 引言
  • 7.2 实验部分
  • 7.2.1 试剂
  • 7.2.2 缓冲溶液
  • 7.2.3 抗体的制备
  • 7.2.4 包被原的制备
  • 7.2.5 辣根过氧化物酶标抗体的制备
  • 7.2.6 免疫柱的制备
  • 7.2.7 仪器与操作步骤
  • 7.3 结果与讨论
  • 7.3.1 免疫反应模式
  • 7.3.2 流动注射化学发光测量条件的选择
  • 7.3.3 免疫反应条件的选择
  • 7.3.4 免疫反应柱的稳定性
  • 7.3.5 工作曲线与检出限
  • 7.3.6 方法应用
  • 7.4 小结
  • 7.5 参考文献
  • 第八章 己烯雌酚人工抗原的合成、抗体的制备
  • 8.1 引言
  • 8.2 实验部分
  • 8.2.1 主要仪器
  • 8.2.2 主要试剂
  • 8.2.3 己烯雌酚单羧甲基醚的合成
  • 8.2.4 己烯雌酚单羧甲基醚与载体蛋白的偶联
  • 8.2.5 己烯雌酚抗体的制备
  • 8.2.5.1 多克隆抗体的制备
  • 8.2.5.2 兔血清抗体效价测定
  • 8.2.5.3 兔血清抗体的特异性
  • 8.3 结果与讨论
  • 8.3.1 己烯雌酚单羧甲基醚半抗原的合成及鉴定
  • 8.3.2 己烯雌酚单羧甲基醚与载体蛋白结合及鉴定
  • 8.3.2.1 己烯雌酚单羧甲基醚与载体蛋白结合反应
  • 8.3.2.2 偶联验证
  • 8.3.2.3 结合比测定
  • 8.3.3 抗血清效价的鉴定
  • 8.3.4 抗体的特异性
  • 8.3.5 抗体的纯化与保存
  • 8.4 小结
  • 8.5 参考文献
  • 第九章 电化学免疫分析方法测定己烯雌酚
  • 9.1 引言
  • 9.2 实验部分
  • 9.2.1 主要仪器
  • 9.2.2 主要试剂
  • 9.2.3 缓冲溶液
  • 9.2.4 抗体的制备
  • 9.2.5 包被原的制备
  • 9.2.6 测定方法
  • 9.3 结果与讨论
  • 9.3.1 免疫反应模式
  • 9.3.2 底物的选择及测量条件
  • 9.3.3 免疫反应条件
  • 9.3.4 工作曲线
  • 9.3.5 样品分析
  • 9.4 小结
  • 9.5 参考文献
  • 第十章 流动注射阻抑化学发光法测定己烯雌酚
  • 10.1 引言
  • 10.2 实验部分
  • 10.2.1 仪器与试剂
  • 10.2.2 实验方法
  • 10.3 结果与讨论
  • 10.3.1 化学发光反应动力学曲线
  • 10.3.2 反应介质的选择
  • 10.3.3 鲁米诺溶液用量的影响
  • 10.3.4 N-溴代丁二酰亚胺用量的影响
  • 10.3.5 工作曲线与检出限
  • 10.3.6 共存物质的影响
  • 10.3.7 样品分析
  • 10.4 小结
  • 10.5 参考文献
  • 第十一章 双酚A的流动注射化学发光法测定
  • 11.1 引言
  • 11.2 实验部分
  • 11.2.1 仪器与试剂
  • 11.2.2 实验方法
  • 11.3 结果与讨论
  • 11.3.1 化学发光信号曲线
  • 11.3.2 反应介质的选择
  • 11.3.3 鲁米诺溶液浓度的影响
  • 3Fe（CN）6溶液浓度的影响'>11.3.4 K3Fe（CN）6溶液浓度的影响
  • 11.3.5 工作曲线与检出限
  • 11.3.6 干扰实验
  • 11.3.7 样品分析
  • 11.3.8 化学发光反应机理初探
  • 11.4 小结
  • 11.5 参考文献
  • 第十二章 双酚A完全抗原、抗体的制备及ECIA方法的建立
  • 12.1 引言
  • 12.2 实验部分
  • 12.2.1 主要仪器
  • 12.2.2 主要试剂
  • 12.2.3 完全抗原的制备及鉴定
  • 12.2.4 双酚A抗体的制备
  • 12.2.4.1 多克隆抗体的制备
  • 12.2.4.2 抗血清效价的测定
  • 12.2.5 BPA的免疫分析
  • 12.3 结果与讨论
  • 12.3.1 4,4-二苯基羟基戊酸与载体蛋白结合反应
  • 12.3.2 偶联验证
  • 12.3.3 结合比测定
  • 12.3.3 抗血清的效价鉴定
  • 12.3.4 抗血清的特异性
  • 12.3.5抗血清的免疫分析法应用
  • 12.3.5.1 免疫反应条件
  • 12.3.5.2 工作曲线
  • 12.3.5.3 血清及桶装纯净水中BPA的测定
  • 12.4 小结
  • 12.5 参考文献
  • 第十三章 增强化学发光酶免疫分析法测定双酚A
  • 13.1 引言
  • 13.2 实验部分
  • 13.2.1 仪器与试剂
  • 13.2.2 实验方法
  • 13.2.2.1 包被原的制备
  • 13.2.2.2 抗双酚A抗体的制备
  • 13.2.2.3 化学发光测定方法的建立
  • 13.2.2.4 双酚A的测定
  • 13.3 结果与讨论
  • 13.3.1 化学发光反应条件的选择
  • 13.3.2 抗BPA抗血清浓度的选择
  • 13.3.3 IgG-HRP稀释比的选择
  • 13.3.4 BPA测定的工作曲线及检出限
  • 13.3.5 水样中BPA的测定
  • 13.4 小结
  • 13.5 参考文献
  • 总结
  • 攻读博士学位期间已发表或待发表的学术论文
  • 致谢

    • 相关论文文献

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