鸭α-干扰素基因疫苗高密度发酵及免疫鸭抗鸭瘟强毒人工感染的研究

论文摘要

本文对鸭α-干扰素基因真核表达质粒（pcDNA-SDIFN-α）的重组大肠杆菌大规模中试生产发酵培养条件、pcDNA-SDIFN-α免疫鸭抗0.5 LD50鸭瘟强毒感染进行系统研究，获如下结果：1．pcDNA-SDIFN-α大规模中试生产发酵培养条件：对pcDNA-SDIFN-α的重组大肠杆菌进行发酵培养条件（温度、pH、溶氧浓度、补料速度、接种量、发酵时间和消泡剂添加量）优化，筛选出了适合DH5α菌株生长的最佳发酵条件为：温度37℃，pH7.4，溶氧含量40％，接种量4％，补料速度80ml／h，发酵时间18h，消泡剂添加量0.02％，此条件下，pcDNA-SDIFN-α质粒含量可达到357mg／L。2．pcDNA-SDIFN-α免疫鸭抗0.5 LD50鸭瘟强毒感染：将pcDNA-SDIFN-α分别按每1μg、3μg和6μg三个剂量基因枪轰击和50μg、100μg、200μg三个剂量肌肉注射免疫北京鸭，以PBS、空载体质粒pcDNA 3.1（+）和鸭瘟弱毒疫苗为对照，免疫15 d后分经皮下、滴鼻、口服三个途径人工感染0.5 LD50鸭瘟强毒（含病毒DNA拷贝数为3.524×104），统计发病死亡情况，并于攻毒后2 h、6 h、12 h、24 h、3d、6d、9d、14d、22d、26d、33d和40d采全血，采用实时荧光定量PCR对鸭瘟病毒在鸭外周血中含量的动态变化进行检测。结果：①pcDNA-SDIFN-α基因枪免疫组鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量比PBS和空载体对照组低，差异显著（P＜0.05），在3d前都低于弱毒疫苗免疫组，差异不显著（P＞0.05）。三个剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组之间外周血鸭瘟病毒DNA含量差异不显著（P＞0.05），攻毒初期（2h），6μg免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量最低，3μg次之，1μg最高。基因枪1μg免疫皮下攻毒组有3／9只鸭死亡，滴鼻攻毒组有3／9只鸭死亡；基因枪3μg免疫滴鼻攻毒组有3／9只鸭死亡；PBS和空载体免疫组分别有13／27和10／27只死亡，基因枪6μg免疫鸭以及鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭获得100％保护。病死鸭的脾脏、十二指肠、空肠、盲肠和直肠是鸭瘟病毒DNA含量较高的组织器官。②pcDNA-SDIFN-α肌肉注射免疫组鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量比PBS和空载体对照组低，差异显著（P＜0.05），在24h前都低于弱毒疫苗免疫组，差异不显著（P＞0.05），攻毒初期（2h），200μg免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量最低，100μg次之，50μg最高。三个剂量pcDNA-SDIFN-α肌肉注射免疫鸭全部存活，PBS和空载体免疫组分别有13／27和10／27只死亡。研究表明，基因枪轰击和肌肉注射pcDNA-SDIFN-α免疫鸭后能产生一定的抗鸭瘟强毒感染的作用，并表现出一定的量效关系。

论文目录

• 目录
• 本论文的创新型研究工作
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 干扰素的研究概况
• 1.1.1 干扰素的分类及理化特性
• 1.1.2 干扰素产生的机理
• 1.1.3 干扰素的生物学活性
• 1.1.3.1 抗病毒作用
• 1.1.3.2 抗肿瘤作用
• 1.1.3.3 免疫调节作用
• 1.1.4 鸭干扰素研究进展
• 1.1.4.1 鸭I干扰素
• 1.1.4.2 鸭II干扰素
• 1.2 基因工程菌的高密度发酵
• 1.3 实验目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 毒株、菌株、质粒及疫苗
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.1.4 主要实验试剂及其配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 发酵罐培养pcDNA-SDIFN-α基因工程菌条件优化
• 2.2.1.1 培养基
• 2.2.1.2 种子液制备
• 2.2.1.3 发酵罐中分批补料培养
• 2.2.1.4 正交实验设计
• 2.2.1.5 菌体浓度测定
• 2.2.1.6 菌体湿重测定
• 2.2.1.7 质粒拷贝测定
• 2.2.2 基因枪“子弹”的准备
• 2.2.3 pcDNA-SDIFN-α的免疫及人工感染鸭瘟强毒
• 2.2.4 样品采集和处理
• 2.2.5 血液中鸭瘟病毒DNA的抽提
• 2.2.6 组织中鸭瘟病毒DNA的抽提
• 2.2.7 TaqMan探针实时荧光定量PCR检测DPV的反应体系和扩增条件
• 2.2.8 TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测鸭瘟病毒DNA标准曲线
• 3 实验结果
• 3.1 正交实验结果
• 3.2 TaqMan探针实时荧光定量PCR对鸭外周血中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.2.1 pcDNA-SDIFN-α基因枪免疫后不同途径攻毒鸭外周血中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.2.1.1 基因枪免疫后皮下攻毒鸭外周血中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.2.1.2 基因枪免疫后滴鼻攻毒鸭外周血中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.2.1.3 基因枪免疫后口服攻毒鸭外周血中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.2.2 pcDNA-SDIFN-α肌肉注射免疫后不同途径攻毒鸭外周血中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.2.2.1 肌肉注射免疫后皮下攻毒鸭外周血中的鸭瘟病毒DNA的定量检
• 3.2.2.2 肌肉注射免疫后滴鼻攻毒鸭外周血中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.2.2.3 肌肉注射免疫后口服攻毒鸭外周血中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.3 TaqMan探针实时荧光定量PCR对病死鸭各组织器官中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.3.1 pcDNA-SDIFN-α基因枪免疫后不同途径攻毒病死鸭各组织器官中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.3.1.1 基因枪免疫后皮下攻毒病死鸭各组织器官中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.3.1.2 基因枪免疫后滴鼻攻毒病死鸭各组织器官中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.3.1.3 基因枪免疫后口服攻毒病死鸭各组织器官中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.3.2 pcDNA-SDIFN-α肌肉注射免疫后不同途径攻毒病死鸭各组织器官中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.3.2.1 肌肉注射免疫皮下攻毒组病死鸭各组织器官中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.3.2.2 肌肉注射免疫滴鼻攻毒组病死鸭各组织器官中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 3.3.2.3 肌肉注射免疫口服攻毒组病死鸭各组织器官中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 4 讨论
• 4.1 发酵培养条件
• 4.1.1 温度
• 4.1.2 pH值
• 4.1.3 溶氧浓度
• 4.1.4 接种量
• 4.1.5 发酵方式的选择
• 4.2 实时荧光定量PCR技术
• 4.3 pcDNA-SDIFN-α基因枪轰击和肌肉注射免疫后不同途径攻毒鸭外周血中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 4.4 免疫途径对pcDNA-IFN-α基因疫苗免疫效果的影响
• 4.5 免疫剂量对pcDNA-IFN-α基因疫苗免疫效果的影响
• 4.6 攻击鸭瘟强毒剂量的选择
• 4.7 TaqMan探针实时荧光定量PCR对病死鸭各组织器官中的鸭瘟病毒DNA的定量检测
• 4.8 鸭瘟强毒感染康复鸭带毒问题
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录