微生物发酵法产紫杉醇的分离提取

论文摘要

紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物,因其独特的抗癌活性而受到各国科学家和研究人员的关注,但由于从红豆杉植物中提取紫杉醇产量极低,因此寻求大量生产紫杉醇的方法也就成为研究的热点。而在众多研究方法中采用工业发酵法产紫杉醇因其产量高,环境污染小,社会效益高,而备受推崇。本文以产紫杉醇内生真菌HD86-9为菌种,以提高紫杉醇产量为目的。其中包括对产紫杉醇发酵条件进行优化、采用简化的分离纯化方法,快速分离纯化紫杉醇,以减小过分离纯化其中的损失。其主要研究结果如下:1、运用响应面方法对发酵培养基进行优化研究,结果显示最佳培养基成分为:葡萄糖 50g/L、NH4NO37g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO40.5g/L、Cu（NO3）28.8×10-3g/L、ZnSO41.9×10-3g/L、FeCL3 10.1×10-3g/L、乙酸钠 1g/L、Ca（NO3）20.25g/L、苯甲酸钠5×10-3g/L,在此条件下发酵得到紫杉醇的产量为290.5μg/L。2、从六种不同的大孔树脂中选择出201×4型号大孔吸附树脂对紫杉醇进行除杂脱色研究,通过对洗脱剂、洗脱浓度的研究,采用最佳方法,使紫杉醇回平均收率为98.25%。3、在初步分离的基上,进一步运用硅胶及碱性氧化铝层析效果,提高紫杉醇的纯化成度。分别对洗脱液组成、洗脱液强度、洗脱速率进行研究,在最佳条件下,经硅胶柱分离后的紫杉醇的回收率在98.28%,纯度达到20.15%,而氧化铝层析后,紫杉醇回收率紫杉醇平均回收率为98.67%,纯度提高到25.48%。4、利用UPLC-MS中的MRM方法对紫杉醇纯化品进行测定,其中紫杉醇平均含量为244.196μg/L,RSD=0.53%,平均加标回收率为94.20%。经本工艺分离纯化后的紫杉醇总回收率约为84%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 紫杉醇的概述
• 1.1.1 紫杉醇的由来
• 1.1.2 紫杉醇的组成
• 1.2 发酵法产紫杉醇
• 1.2.1 微生物法生产紫杉醇带来的社会效益
• 1.2.2 微生物法生产紫杉醇的巨大环境和经济效应
• 1.2.3 微生物发酵法生产紫杉醇的独特之处
• 1.2.4 提高方发酵法生产紫杉醇的主要方法
• 1.3 紫杉醇提取及初分离工艺
• 1.3.1 溶剂初提法
• 1.3.2 固相萃取法
• 1.3.3 膜分离技术
• 1.3.4 树脂层析法
• 1.4 紫杉醇的纯化概述
• 1.4.1 色谱柱法
• 1.4.2 新型色谱法
• 1.4.3 化学反应法
• 1.4.4 药物靶点法
• 1.5 紫杉醇的分析检测方法
• 1.5.1 高效液相色谱分析法
• 1.5.2 薄层层析分析法
• 1.5.3 质谱法
• 1.5.4 核磁共振光谱法
• 1.5.5 免疫学分析法
• 1.5.6 毛细管电泳法
• 1.5.7 细胞生物学方法
• 1.5.8 荧光学方法
• 1.6 本论文研究意义及主要研究内容
• 1.6.1 论文研究的意义
• 1.6.2 论文研究的主要内容
• 第2章 HD86-9菌株的发酵条件优化研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 培养方法
• 2.2.5 响应面分析方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 不同碳源的影响
• 2.3.2 不同氮源的影响
• 2.3.3 Plackett-Burman实验设计研究微量元素的影响
• 2.3.4 最陡爬坡实验
• 2.3.5 CCD优化设计结果与响应面分析
• 2.4 本章小结
• 第3章 紫杉醇初分离工艺
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 药品与试剂
• 3.2.2 仪器设备
• 3.3 方法
• 3.3.1 乙酸乙酯萃取
• 3.3.2 大孔树脂层析优化
• 3.3.3 统计差异性分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 萃取剂比较
• 3.4.2 树脂层析
• 3.5 本章小节
• 第4章 正相层析分离紫杉醇工艺研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 药品与试剂
• 4.2.2 仪器设备
• 4.3 方法
• 4.3.1 硅胶层析
• 4.3.2 碱性氧化铝层析
• 4.3.3 统计差异性分析
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 硅胶层析试验结果
• 4.4.2 碱性氧化铝层析试验结果
• 4.5 本章小结
• 第5章 UPLC-MS/MS测定发酵液中紫杉醇含量
• 5.1 引言
• 5.2 材料
• 5.2.1 药品与试剂
• 5.2.2 仪器与条件
• 5.2.3 方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 紫杉醇的测定
• 5.3.2 标准曲线的测定
• 5.3.3 精密度试验
• 5.3.4 实际样品测定
• 5.3.5 稳定性试验
• 5.3.6 重复性试验
• 5.3.7 加标回收率试验
• 5.4 本章小节
• 第6章 结论
• 第7章 本论文的创新点
• 参考文献
• 致谢