系列壳寡糖衍生物的制备及其对神经细胞保护作用的研究

论文摘要

近年来阿尔茨海默病的发病率逐渐升高,给社会和家庭造成了严重的经济、精神负担。但目前的临床药物只能延缓病情的发展,并不能彻底地治愈阿尔茨海默病,且有一定的毒副作用。因此开发低毒、高效的治疗阿尔茨海默病的药物是十分重要的。阿尔茨海默病的主要病理特征之一为神经细胞的大量丢失,因此保护神经元可以有效地缓解和治疗阿尔茨海默病。壳寡糖是天然存在的碱性氨基寡糖,具有广泛的生物活性。最近,许多研究表明壳寡糖具有神经细胞保护作用,有望开发成一种神经保护剂,用于治疗阿尔茨海默病。本文以酶解制备的壳寡糖混合物为起始原料,制备了三种系列的壳寡糖及其衍生物单体。首先通过凝胶柱色谱分离得到了五个壳寡糖单体：壳三糖、壳四糖、壳五糖、壳六糖和壳七糖。然后采用化学修饰的方法制备了3个全乙酰壳寡糖单体和3个N-乙酰壳寡糖单体：全乙酰壳二糖、全乙酰壳三糖、全乙酰壳四糖,N-乙酰壳二糖、N-乙酰壳三糖、N-乙酰壳四糖。采用薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）对得到的11个单体化合物进行了纯度分析；并采用红外光谱（IR）、质谱（MS）、核磁（NMR）对化合物进行了结构确证和表征。利用氯化铜和谷氨酸对PC-12细胞诱导建立两种神经细胞损伤模型,在细胞水平上对不同系列的壳寡糖及其衍生物单体进行神经保护作用的活性筛选。结果表明,全乙酰化壳寡糖三个单体活性最佳,具有显著性的保护作用,可以将细胞活力由40%提高到90%左右,并且保护作用为全乙酰四糖>全乙酰三糖>全乙酰二糖,且中剂量（200μg/mL）的作用效果优于低剂量（100μg/mL）和高剂量组（400μg/mL）;壳寡糖样品的神经细胞保护作用也比较好,其中壳六糖具有一定的保护作用（与模型组相比,可将细胞活力提高16%）。进一步研究发现全乙酰壳寡糖单体可以降低谷氨酸诱导的细胞内活性氧（ROS）的堆积,减少乳酸脱氢酶（LDH）的释放,并能够提升线粒体膜电位（MMP）,上述研究表明全乙酰壳寡糖可能通过降低细胞内ROS的产生,减轻氧化损伤,从而发挥神经细胞保护作用。本论文初步研究了3种不同系列的壳寡糖及其衍生物单体对神经细胞的保护作用,提示壳寡糖可以作为一种神经保护剂,用于治疗神经退行性疾病。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 壳寡糖的简介
• 1.2 壳寡糖的制备研究进展
• 1.2.1 酶降解法
• 1.2.2 酸降解
• 1.2.3 酶酸连续降解
• 1.2.4 氧化降解
• 1.2.5 超声波降解
• 1.3 壳寡糖的分离方法
• 1.3.1 离子交换色谱法
• 1.3.2 固定金属亲和层析色谱法（IMAC）分离壳寡糖
• 1.3.3 凝胶过滤色谱分离壳寡糖
• 1.3.4 衍生化法分离壳寡糖
• 1.4 壳寡糖及其衍生物在阿尔茨海默病（AD）中的应用
• 1.4.1 对神经元的保护和再生
• 1.4.2 β分泌酶的抑制活性
• 1.4.3 清除ROS
• 1.4.4 对铜离子的吸附作用
• 1.4.5 抑制乙酰胆碱酯酶活性
• 1.5 立题依据和研究内容
• 第二章 壳寡糖单体的制备及其理化性质
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 壳寡糖混合物COS的制备
• 2.2.2 壳寡糖混合物COS的分析
• 2.2.2.1 薄层层析（TLC）分析
• 2.2.2.2 高效液相色谱（HPLC）分析
• 2.2.2.3 质谱分析
• 2.2.3 不同聚合度壳寡糖单体化合物的分离
• 2.2.4 壳寡糖单体化合物的纯度分析
• 2.2.4.1 TLC分析
• 2.2.4.2 HPLC分析
• 2.2.5 壳寡糖单体化合物的结构表征
• D²⁵)的分析'>2.2.5.1 比旋光度([α]_D²⁵)的分析
• 2.2.5.2 质谱分析
• 2.2.5.3 红外光谱（IR）分析
• 2.2.5.4 核磁共振（NMR）分析
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 壳寡糖混合物COS的制备
• 2.3.2 壳寡糖混合物COS的分析
• 2.3.2.1 COS的TLC分析
• 2.3.2.2 COS的HPLC分析
• 2.3.2.3 COS的质谱分析
• 2.3.3 壳寡糖单体化合物的分离
• 2.3.4 壳寡糖单体化合物的纯度分析
• 2.3.4.1 TLC分析
• 2.3.4.2 HPLC分析
• 2.3.5 壳寡糖单体化合物的结构表征
• 2.3.5.1 比旋光度分析
• 2.3.5.2 质谱分析
• 2.3.5.3 壳寡糖单体的红外光谱分析
• 2.3.5.4 核磁（NMR）分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 全乙酰及N-乙酰壳寡糖单体的制备及其理化性质
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 全乙酰壳寡糖样品的制备
• 3.2.2 全乙酰壳寡糖单体的分离
• 3.2.3 N-乙酰壳寡糖样品的制备及分离
• 3.2.4 单体化合物的纯度分析
• 3.2.4.1 TLC分析
• 3.2.4.2 HPLC分析
• 3.2.5 单体化合物的结构表征
• D²⁵)的分析'>3.2.5.1 比旋光度([α]_D²⁵)的分析
• 3.2.5.2 质谱分析
• 3.2.5.3 红外光谱分析
• 3.2.5.4 NMR谱分析
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 全乙酰化壳寡糖的制备
• 3.3.2 全乙酰化壳寡糖的分离纯化
• 3.3.3 N-乙酰壳寡糖的制备及分离纯化
• 3.3.4 单体化合物的纯度分析结果
• 3.3.4.1 TLC分析
• 3.3.4.2 HPLC分析
• 3.3.5 单体化合物的结构表征
• D²⁵)分析'>3.3.5.1 比旋光度([α]_D²⁵)分析
• 3.3.5.2 质谱分析
• 3.3.5.3 红外光谱分析
• 3.3.5.4 NMR谱分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 壳寡糖及其衍生物对神经细胞的保护作用
• 4.1 实验材料与仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 PC-12细胞的体外培养
• 4.2.1.1 PC-12细胞的培养条件
• 4.2.1.2 PC-12细胞的复苏
• 4.2.1.3 PC-12细胞的传代
• 4.2.1.4 PC-12细胞的冻存
• 4.2.2 样品细胞毒性测定
• 4.2.3 氯化铜损伤模型的建立
• 4.2.4 谷氨酸损伤模型的建立
• 4.2.5 样品对氯化铜诱导细胞损伤的保护作用
• 4.2.6 样品对谷氨酸诱导细胞损伤的保护作用
• 4.2.7 LDH、ROS、MMP指标测定
• 4.2.8 全乙酰壳寡糖单体低剂量活性筛选
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 样品细胞毒性测定
• 4.3.2 氯化铜损伤模型的建立
• 4.3.3 谷氨酸损伤模型的建立
• 4.3.4 样品对氯化铜诱导细胞损伤的保护作用
• 4.3.5 样品对谷氨酸诱导细胞损伤的保护作用
• 4.3.6 LDH、ROS、MMP测定
• 4.3.7 全乙酰壳寡糖单体低剂量活性筛选
• 4.4 本章小结
• 结论与创新点
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 发表论文
• 个人简历