一、Inhibitory Effect of Sodium Selenite on Microsatellite Instability of RER~+ Colorectal Cancer Cells（论文文献综述）
韩玮[1]（2021）在《苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究》文中认为目的:观察苦豆碱（ALO）对结直肠癌（CRC）细胞生物学行为的影响,研究苦豆碱在CRC中对miR-296-5p和转导和转录激活因子3（STAT3）的表达影响,从而进一步探讨苦豆碱抗CRC的作用及其潜在机制。方法:1.用不同浓度的ALO处理细胞,MTT法检测CRC细胞增殖。2.qRT-PCR检测不同浓度的ALO处理CRC细胞中miR-296-5p的表达。3.利用生物信息网站TargetScan V7.2对基于miRNA序列的靶基因进行预测,并采用双荧光素酶报告分析（dual-luciferase reporter assay）对预测结果进行验证。4.在室温下转染或共转染miR-296-5p mimics、过表达 STAT3 质粒、miR-296-5p inhibitor、siSTAT3,并且予以 ALO 处理。采用 qRT-PCR 检测处理后CRC细胞miR-296-5p的表达情况,Western blot检测STAT3的表达情况。5.采用细胞克隆形成实验检测ALO处理后转染的HCT116和SW480细胞增殖影响情况,使用流式细胞仪检测细胞凋亡影响情况,最后采用western-blot检测细胞凋亡蛋白相关影响情况。6.采用划痕愈合实验检测ALO对采用不同转染方案的HCT116和SW480细胞迁移影响,使用Transwell侵袭试验细胞侵袭影响。7.采用western-blot检测处理后EMT相关蛋白N-cadherin和E-cadherin的表达影响况。结果:1.采用MTT法检测,结果表明ALO对不同CRC细胞增殖具有不同程度抑制作用,并且具有剂量依耐性。其中针对不同的CRC细胞抑制作用不同,以对SW480细胞增殖的抑制作用最强,但对HCT116细胞增殖的抑制作用最弱,并且SW480细胞的IC50为 0.611mmol/L,而 HCT116 细胞的 IC50 为 1.141mmol/L。2.通过 StarBasev3.0 分析比较了结直肠腺癌和正常样本miR-296-5p,明确了 miR-296-5p再结直肠腺癌中低表达,再通过 qRT-PCR 验证了 CRC 细胞系（SW480、HCT116、HT29、SW620）内 miR-296-5p 的表达低于人肠上皮细胞HIEC,并且miR-296-5p在SW480细胞表达最高,HCT116表达最低。选择SW480细胞和HCT116细胞做为代表,经过ALO处理24h后,检测两者miR-296-5p表达,结果表明ALO能够上调SW480细胞和HCT116细胞miR-296-5p的表达,并且呈现剂量依赖性。3.采用TargetScan V7.2对miR-296-5p进行靶基因预后,结果提示STAT3是靶基因,并且目标位点位于3’-UTR。构建野生型（STAT3-WT）和突变型（STAT3-MUT）基因靶点STAT3的3’UTR-荧光素酶表达载体。对miR-296-5p表达最低的HCT116细胞行miR-296-5p mimic共转染,对miR-296-5p表达最高的SW480细胞进行miR-296-5p inhibitor共转染。双荧光素酶报告基因系统分析后,结果提示与STAT3-MUT共转染的细胞相比,miR-296-5p mimic和STAT3-WT共转染的HCT116细胞的荧光素酶活性明显抑制,而与miR-296-5p inhibitor和STAT3-WT共转染的SW480细胞的荧光素酶活性增强,从而证明STAT3是miR-296-5p靶基因。4.miR-296-5p mimics和ALO都抑制了 CRC细胞中STAT3的表达,但miR-296-5p inhibitor增强了 STAT3的表达。从而得出结论:上调MIR-296-5p和ALO处理均抑制STAT3的表达。5.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的增殖以及Bcl-2的表达,但促进凋亡以及Bax表达,并且这些作用都通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞增殖和凋亡。6.上调miR-296-5p和ALO抑制了 CRC细胞的迁移、侵袭,并且通过过表达的STAT3逆转。实验结果表明ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC细胞迁移和侵袭。7.上调miR-296-5p和ALO抑制CRC细胞的N-cadherin的表达,但促进E-cadherin的表达,这些作用可以被过表达的STAT3逆转,结果表明:ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达。结论:ALO以剂量依赖性的方式抑制CRC细胞增殖。miR-296-5p在CRC组织和细胞中低表达,ALO促进miR-296-5p的表达。STAT3是mi R-296-5p的靶基因,上调miR-296-5p和ALO均抑制STAT3的表达。ALO可以通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控CRC的增殖、凋亡、迁移、侵袭和EMT。
彭宇[2]（2018）在《用于癌症预防药物研究的烟草诱导细胞恶性转化模型的建立与初步评价》文中认为背景:癌症化学预防是指利用药物降低癌症发生风险,延缓癌症发展及防止癌症复发,是一种有效的抗癌策略。目前癌症预防药物的研究主要是基于动物实验以及流行病学实验开展的,实验成本高且实验周期长。而基于细胞平台的实验则能直接反应药物在细胞上的作用,能实现高通量筛选,缩短实验周期。但目前适用于研究癌症预防药物的细胞模型尚不成熟,Bhas 42细胞体外转化实验是一种经典的致癌物检测技术,本文希望通过采用稳定的致癌物诱导细胞发生转化,并在此基础上观察药物对转化结果的逆转作用,开发适用于研究癌症预防药物的细胞模型。中药复方百合固金方为治肺肾阴虚之剂,有养阴清热、凉血止血、润肺止咳之功效,方中药味所含化学成分具有癌症预防相关活性报道,具有研究肺癌化学预防作用的潜在价值。目的:本文希望以香烟烟气冷凝物（CSC）诱导Bhas42细胞发生恶性转化实验为基础,建立适宜于筛选和研究癌症预防药物的细胞模型,并以此模型为基础,考察百合固金方及其中药味的癌症化学预防作用。方法:1.CSC的制备与一致性表征:收集7个品牌市售混合型香烟,采用剑桥滤膜吸附法富集香烟烟气冷凝物。将富集后的剑桥滤膜溶于溶剂中超声萃取,基于GC-MS平台和指纹图谱技术,对CSC成分进行定性分析,并评价其一致性。2.CSC诱导细胞恶性转化模型的建立及其分子机制的研究:首先利用CCK-8法考察不同浓度的CSC对细胞活力的影响,确定CSC的安全剂量。其次通过转化灶形成实验考察CSC的诱导细胞发生转化的能力,即将Bhas 42细胞接种到六孔板中,用CSC诱导细胞发生转化,培养至第21天,计算转化灶的数量。最后将细胞转化灶扩增,形成转化的Bhas42细胞系（T-Bhas42）,采用ELISA法测定细胞转化前后α-SMA蛋白的表达量变化,采用RT-PCR法测定细胞转化前后TGF-β1、Smad4、α-SMA基因的表达量变化,采用流式细胞法检测细胞转化前后周期的分布情况,探究细胞的转化机制,为癌症化学预防药物的机制研究奠定基础。3.细胞转化模型用于筛选癌症预防药物的可行性研究:基于上述细胞转化模型,用不同浓度的水杨酸、姜黄素、亚硒酸钠以及阿魏酸四种有效单体对转化过程进行干预,计算转化灶的数量,考察四种具有癌症化学预防作用的有效单体对细胞转化灶形成的影响。4.百合固金方及其中药味的癌症预防作用的考察:参考2015版《中国药典》中百合固金口服液的提取工艺,采用水提醇沉的方法制备全方及方中各药味提取物,考察各其抑制细胞转化灶形成的能力,同时对比熟地黄+麦冬、熟地黄+当归、当归+麦冬、熟地黄+当归+白芍（养血滋阴类）、川贝母+桔梗+甘草（止咳化痰类）、百合+生地黄+麦冬+玄参（养阴清热类）方中药味配伍应用抑制转化灶形成的能力。采用Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,通过考察脏器指数、肿瘤发生率和肿瘤体积,验证细胞试验所筛选出的药味及药味配伍在整体动物水平上的癌症预防作用。结果:1.采用剑桥滤膜吸附法制备CSC工艺稳定,得率为8.95±1.78μg·支-1,GC-MS结果显示本法制得的CSC成分复杂,多为环烃类结构,以尼古丁和三醋酸甘油酯为主,峰面积占比分别为64.69%和22.81%。指纹图谱相似度分析结果显示且不同品牌间烟气冷凝物的相似度值均不低于0.98,说明所制备的CSC一致性良好,可用于诱导细胞转化。2.用25 μg/mL的CSC对细胞造模后,可见有明显且稳定的恶性转化灶形成（10.5±2.5个·孔-1）,与对照组（1.5±0.5个·孔-1）相比具有显着性差异,证明模型建立成功。ELISA结果显示转化后的细胞α-SMA表达量与正常的Bhas 42细胞相比显着下降（P<0.05）;RT-PCR结果显示,与Bhas42细胞相比,T-Bhas42细胞的TGF-β1、Smad4以及α-SMA三个基因的相对表达量均有不同程度的下降,且差异具有显着性（P<0.05）;流式检测细胞周期结果表明,与Bhas 42细胞相比,T-Bhas 42细胞处于S期的细胞比例增加,处于G0/G1期细胞比例减少（P<0.05）。证明CSC可能通过调节TGF-β通路诱导Bhas 42细胞发生转化,形成具有更强生长和增殖能力的恶性转化细胞。3.有效单体干预实验显示,不同剂量的水杨酸、阿魏酸、姜黄素和亚硒酸钠均能不同程度地抑制恶性转化灶的生成,与模型组相比具有显着性差异,初步证明本文所建立的细胞模型能够体现有效单体的癌症预防作用,具有用于研究癌症预防药物的潜力。4.百合固金方的干预实验显示,熟地和当归单用及联用均可以明显减少细胞转化灶的数量,与模型组相比具有显着性差异（P<0.05）。小鼠肺癌移植瘤预防实验表明,细胞模型所筛选的熟地和当归均能显着抑制肿瘤的发生与发展,相较百合固金方全方具有更明显的作用趋势,表现出与细胞模型筛选结果的一致性。体现了香烟烟气冷凝物诱导Bhas 42细胞转化模型在筛选癌症预防药物的上的意义。结论:基于CSC诱导Bhas 42细胞转化实验,初步建立了适用于研究癌症预防药物的细胞模型,利用己知有效单体对该模型进行初步评价,模型稳定性和可行性表现良好。基于本细胞模型筛选出了百合固金方中癌症化学预防作用明显的药味及配伍组合,并通过动物实验初步验证了模型筛选结果的可靠性。
袁媛[3]（2018）在《HOXA10蛋白上调对结直肠癌预后的指导意义》文中提出结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全世界男性和女性中最普遍、最致命的肿瘤类型之一。几十年前结直肠癌还是发病率较低的恶性肿瘤。然而目前,它已成为发病率最高的消化道恶性肿瘤,并且约占西方国家癌症相关死亡原因10%。我国虽然是发展中国家,但大肠癌在我国情况也不容乐观。近年来结直肠癌的发病率及死亡率一直呈现增长趋势。在发达国家的结肠直肠癌发病率的“上升”,可以归因于日益老龄化的人口、不良的现代饮食习惯以及吸烟、低运动量和肥胖等危险因素的增加。尽管目前已经广泛采取了有效的预防筛查措施,以及近年来综合治疗方案的众多重大进展,结直肠癌仍是最威胁人类健康的恶性肿瘤之一。导致这种境况的重要原因之一就是耐药。尽管在细胞毒性和靶向治疗方面取得了进展,目前对治疗耐药性的长期管理,仍然是针对无法治愈的转移性癌症的最大挑战之一。因为耐药可使肿瘤积累了逃避各种治疗的手段,并最终导致死亡。同源盒（HOX）基因是胚胎形态发生和分化的重要调控因子,HOX基因家族在发育、分化、凋亡、血管生成、运动和受体信号传递等方面起着关键作用。也正因如此,这些基因表达的变化可能对肿瘤发生和肿瘤进展以及癌症诊断和治疗有重要影响。许多研究表明,不同的同源盒基因在某些器官中可差异性表现为有肿瘤抑制或肿瘤促进作用。就其致癌基因性质而言,同源盒基因通常在胚胎期表达,在肿瘤中重新激活,在正常分化的成人组织中被下调。相反,某些同源框基因在正常分化的成人组织中表达,但在肿瘤中被下调。有趣的是,同源框基因可能同时具有肿瘤促进和肿瘤抑制特性,这取决于表达的特定器官或细胞谱系。一些长或短的非编码RNA也参与调控同源框基因的转录或表达。因此,了解特定癌症类型或细胞谱系中同源盒基因的异常表达模式及其对某些类型癌症的致癌和侵袭机制非常重要。许多研究表明HOX基因表达有助于CRC的发展。HOXA10基因作为HOX家族的成员,也是胚胎形态发生和分化的调节因子,但在几种类型的癌症中都表现不明显。曾有报道HOXA10的解除管制与子宫内膜癌的进展有关,但同时HOXA10也可诱导乳腺癌细胞中p53的表达,降低其侵袭性。同时,HOXA10也是参与造血干细胞和祖细胞增殖的转录因子。它的过度表达与癌症的发展和急性髓系白血病和固体癌症患者的不良预后有关。这种同时具备的癌基因及抑癌基因的特性,在结直肠癌中,究竟表现为何种,目前仍是未知。HOXA10在结直肠癌的发生发展中究竟是否扮演了什么样的角色,目前尚不清楚。因此研究HOXA10在结直肠癌中的表达状态及功能机制,在临床中可能有着极为积极的意义。本研究通过探讨HOXA10蛋白在结直肠癌患者中的表达,试图阐明其临床意义,并解释其与结直肠癌预后、预测的关系。第一部分HOXA10蛋白表达与结直肠癌临床病理特征及预后的相关性目的:1.通过描述HOXA10在结直肠癌的表达状态,探讨其在结直肠癌发生中的作用意义。2.通过观察HOXA10和PTEN在结直肠癌表达状态的关系,解释HOXA10对结直肠癌预后的预测意义。方法:1.检索了来自Oncomine数据库关于HOXA10蛋白在结直肠癌表达的独立研究。2.随访2005年2月至2010年2月期间,在徐州市中心医院接受结直肠癌根治性切除,并术后接受含5-FU（5-氟尿嘧啶）或其衍生物的术后辅助化疗的CRC患者,随访终点为疾病进展。3.免疫组织化学检测癌和正常组织中HOXA10、PTEN的表达,分析HOXA10表达与结直肠癌5年DFS的相关性。结果:1.检索到Oncomine数据库的7项独立研究显示,与正常对照组相比,HOXA10在CRC组织中呈高度表达。2.总计完整随访了2005年2月至2010年2月期间,在徐州市中心医院接受结直肠癌根治性切除,并术后接受含5-FU（5-氟尿嘧啶）或其衍生物的术后辅助化疗的CRC患者85例。中位随访时间97月（6120月）,期间70例患者在术后5年内复发转移。3.免疫组化显示,有58例（68.2%）在肿瘤组织中显示了HOXA10蛋白的阳性表达,而在配对的癌旁正常组织中呈阴性表达。且HOXA10蛋白上调与PTEN下调同步。尽管与临床病理特征无关,但在HOXA10的上调与减少5年无病生存（DFS）之间存在显着相关性。Cox比例风险模型进一步揭示,除了淋巴结转移,HOXA10表达是CRC患者DFS预测的独立因素。结论:1.相对于正常组织,HOXA10蛋白在大多数结直肠癌中过度表达。2.HOXA10蛋白上调与PTEN下调同步,其上调与减少5年无病生存（DFS）相关。3.HOXA10在结肠癌中可能是一种潜在的生物标志物,其过度表达提示预后不良。4.HOXA10可能通过下调PTEN水平影响结直肠癌的预后。第二部分HOXA10基因在结直肠癌细胞中的功能研究目的:1.观察HOXA10基因敲降对结直肠癌细胞生物学行为的影响。2.观察HOXA10基因敲降对结直肠癌细胞5-FU化疗敏感性的影响。方法:1.用慢病毒介导的RNA干扰抑制Lo Vo和HT-29细胞株中的HOXA10表达,形成稳定低表达HOXA10的细胞株,并检测细胞的增殖、凋亡和集落形成变化。2.用5-FU梯度浓度干预上述细胞株,检测细胞的增殖变化。3.将各组细胞株种植于裸鼠右下肢成瘤,对比加用5-FU化疗与否对结直肠癌种植瘤的生长情况。结果:1.HOXA10敲除可降低HOXA10蛋白的表达。2.HOXA10敲除的Lo Vo和HT-29细胞生长明显受到抑制,凋亡增加,对5-FU的IC50值降低。3.HOXA10基因敲除可增强Lo Vo和HT-29细胞种植裸鼠对5-FU的化疗敏感性。结论:1.通过慢病毒介导的RNA干扰,成功构建HOXA10表达降低的Lo Vo和HT29细胞系。2.HOXA10基因敲除抑制结直肠癌细胞的增殖,增加其凋亡。3.HOXA10基因敲除增加了结直肠癌细胞株对5-FU的化疗敏感性。第三部分 miR-135a调控HOXA10影响5-Fu化疗敏感性的研究目的:1.寻找HOXA10的上游调控因子miRNA。2.验证上述miRNA功能,明确其作用机制。方法:1.通过生物信息学预测与HOXA10结合的miRNA,并通过Luciferase实验验证。2.通过化学合成上述鉴定过的miRNA,并转染Lo Vo和HT29细胞,并观察细胞增殖、凋亡及其对5-FU的IC50改变;3.Lo Vo和HT29细胞共转染miRNA mimics与HOXA10过表达载体,观察细胞增殖、凋亡及其对5-FU的IC50改变。结果:1.利用mi Rcode和Target Scan网站分析HOXA10的上游调控miRNA,初步筛选出mi R-135a和mi R-135b可与HOXA10非编码区互补结合。2.Luciferase实验证实HOXA10是mi R-135a和mi R-135b的作用靶点。3.Realtime PCR证实在结直肠癌Lo Vo和HT29细胞中,mi R-135a的表达均较HCo Epi C人结肠上皮细胞显着下调。4.转染了mi R-135a mimics的Lo Vo和HT29细胞,增殖受到抑制,凋亡增加,且对5-Fu的IC50降低。5.转染mi R-135a mimic作用后再使HOXA10过表达,可在一定程度逆转mi R-135a的作用。结论:1.mi R-135a是HOXA10的上游调节因子。2.mi R-135a过表达可抑制Lo Vo和HT29细胞的增殖、诱导其凋亡,且增加其对5-Fu的敏感性。3.mi R-135a可能通过抑制HOXA10过表达发挥作用。
王浩甲[4]（2017）在《汉黄芩素调控P53核转位干预结直肠癌的作用机制》文中提出目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）作为当今世界发病率第三,致死率第四的恶性肿瘤,在2012年世界范围内的发病数达到了约136万例,而死亡数接近一半。虽然死亡率每年都会有所降低,但是发病率却仍持续逐年上升,因此,化学预防是降低结直肠癌发病的重心。汉黄芩素是一类提取于唇形科植物黄芩根的黄酮类化合物,据文献报道,其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化以及抗菌的作用。体外研究表明汉黄芩素能够抑制肿瘤细胞的增殖和生长,并且可以诱导肿瘤细胞凋亡。P53是目前已知的与肿瘤发生发展相关性最高的抑癌基因之一,其主要的功能是通过引起细胞周期阻滞、DNA修复以及诱导异常细胞凋亡来维持基因组和细胞的稳态,从而对肿瘤的发生和发展起到抑制作用。P53的亚细胞定位对肿瘤细胞的命运会产生不同的影响,当P53定位于细胞质中时会抑制肿瘤细胞的自噬,而当P53定位于细胞核中时,会促进细胞产生自噬。基于目前的研究现状,本文将利用AOM/DSS化学诱导小鼠结肠癌模型来评价汉黄芩素对结直肠癌的化学预防作用,并且结合体外细胞模型探索其抑制结直肠癌发生发展的作用机制。方法:1.汉黄芩素抑制结直肠癌细胞增殖,并且调节自噬与凋亡采用结肠癌细胞HCT116与HT29细胞作为体外研究模型,经过不同浓度的汉黄芩素（0-8Oμ M）处理72小时之后采用MTT法检测汉黄芩素对两种细胞的增殖抑制能力,根据MTT得到的IC50确定出后续实验的给药剂量,继而采用平板克隆实验来验证汉黄芩素对这两种细胞的克隆形成能力。然后通过蛋白免疫印迹法（Western blot）和流式细胞术（Flow cytometry）检测了汉黄芩素对HCT116与HT29结肠癌细胞自噬和凋亡的影响。2.汉黄零素调节结直肠癌细胞内的活性氧水平采用汉黄芩素处理HCT116与HT29细胞2小时之后收取细胞样品,按照活性氧检测试剂盒的操作步骤对细胞内的活性氧进行荧光染色标记之后采用流式细胞仪检测细胞中活性氧的改变情况。3.汉黄芩素调节结直肠癌细胞内质网应激和DNA损伤由MTT法确定出后续实验的给药浓度,然后用所确定浓度的汉黄芩素处理HCT116与HT29结肠癌细胞72小时,提取总蛋白,用Western blot技术来检测汉黄芩素对这两种细胞的内质网应激和DNA损伤通路的影响,并采用Real-time PCR检测内质网应激通路中下游基因DDIT3和XBPI的表达水平。最后采用单细胞凝胶电泳实验（彗星拖尾实验）来观察汉黄芩素对HCT116与HT29结肠癌细胞DNA损伤的影响。4.汉黄芩素对结肠癌细胞P53核转位的影响药物处理HCT116与HT29结肠癌细胞后分别提取总蛋白以及胞浆胞核蛋白,采用Western blot技术检测药物对总蛋白中P53核转位相关的磷酸化P53蛋白水平,然后再分别检测胞浆胞核蛋白中的磷酸化P53蛋白水平。最后,采用细胞免疫荧光实验来观察汉黄芩素对HCT116与HT29结肠癌细胞P53核转位相关的磷酸化蛋白表达水平的影响。5.汉黄芩素对AOM/DSS化学诱导结直肠癌动物模型的预防作用研究本章节采用AOM/DSS诱导的炎症性结直肠癌的动物模型,汉黄芩素给药处理20周,考察汉黄芩素对结直肠癌形成和发展过程中的化学预防作用。造模期间定期记录动物体重,观察动物状态,以便评估汉黄芩素对动物是否有毒性。在实验终点时,统计每组小鼠的肿瘤发生率和结肠长度,采用Western blot法检测自噬、凋亡、内质网应激和DNA损伤相关蛋白的表达水平。6.统计分析数据分析采用SPSS 17.0统计软件来进行,采用One way ANOVA来比较多个处理组之间的均数,P<0.05表示处理组之间具有显着性差异。采用GraphPad 5.0数据分析软件作图,数据结果以Mean 土 SD表示。结果:1.汉黄岑素显着抑制HCT116和HT29结肠癌细胞的增殖,并且对这两种结肠癌细胞的自噬和凋亡产生不同的作用经汉黄芩素给药72小时之后,汉黄芩素在这两种细胞上的IC50分别为70.14 14μM和117.9 μM,10μ M的汉黄芩素即可对HCT116和HT29结肠癌细胞产生明显的抑制作用。经过平板克隆实验我们观察到汉黄芩素对HCT116和HT29结肠癌细胞克隆形成能力均有明显的抑制作用。与此同时,汉黄芩素抑制了 HCT116细胞的自噬,诱导其产生凋亡。相反地,汉黄芩素处理72小时能够显着地促进HT29细胞的自噬,但是汉黄芩素处理24小时之后却能够抑制到HT29细胞的凋亡。2.汉黄芩素刺激HCT116细胞内活性氧的产生,而抑制HT29细胞内活性氧的释放汉黄芩素处理HCT116和HT29结肠癌细胞2小时之后收取细胞样品,经过流式细胞仪检测后发现,汉黄芩素能诱导HCT116细胞内活性氧的产生,经过统计后发现,相对于对照组其细胞内活性氧染料荧光的百分比显着增加,而经过还原剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理后,HCT116细胞内的活性氧水平显着降低;然而在HT29细胞中,汉黄芩素处理两个小时之后抑制了细胞内活性氧的产生。3.汉黄芩素能够促进HCT116内质网应激和DNA损伤,抑制HT29内质网应激和DNA损伤HCT116和HT29结肠癌细胞给予汉黄芩素处理72小时之后检测药物对这两种细胞内质网应激和DNA损伤的影响水平。结果显示,汉黄芩素能够诱导HCT116细胞产生内质网应激,显着上调该通路相关蛋白以及下游靶基因DDIT3和XBP1表达水平;汉黄芩素作用于HT29后抑制其内质网应激作用,显着下调该通路相关蛋白表达量,以及其下游靶基因DDIT3和XBP1的表达水平。与此同时,汉黄芩素能够诱导HCCT116细胞产生DNA损伤,激活该通路相关蛋白,单细胞凝胶电泳实验也显示出细胞出现较长的拖尾现象;汉黄芩素作用于HT29之后抑制了其DNA损伤作用,与该通路相关蛋白表达量有所下调,单细胞凝胶电泳实验未观察到细胞出现拖尾现象。4.汉黄等素促进了 p53在HCT116细胞中的胞浆定位,促进了 p53在HT29细胞中的胞核定位。在HCT116细胞的总蛋白中,汉黄芩素作用后可以显着增加p-p53（ser315）和p-p53（ser376）的水平,而且细胞免疫荧光实验结果表明,汉黄芩素可以促进p-p53（ser15）在细胞质中积累,增加p53在HCT116细胞中的胞浆定位。在HT29细胞的总蛋白中,汉黄岑1素降低p-p53（ser315）和p-p53（ser376）的水平,而且细胞免疫荧光实验的结果显示,汉黄芩素可以促进p-p53（ser15）在细胞核中的积累,促使P53在HT29细胞中的胞核定位。5.汉黄芩素体内化学预防结直肠癌作用的机制在由AOM/DSS诱导的炎症性结直肠癌动物模型中,汉黄芩素能够显着地降低结直肠癌的发生率。在持续二十周的给药之后,各组小鼠之间的体重并未出现明显的差异,并且在给药之后由炎症引起的结肠缩短也得到了很好地恢复。此外,给药之后动物体内的内质网应激和DNA损伤均上调,并且自噬水平显着降低,凋亡细胞显着升高。结论:本课题采用体外结肠癌细胞和AOM/DSS诱导的炎症性结直肠癌动物模型来探讨了汉黄芩素对结直肠癌预防的作用机制。研究发现汉黄芩素能够影响ROS产生,调控内质网应激和DNA损伤通路,进而对p53的核转位功能产生影响,最终通过凋亡或自噬通路诱导细胞死亡。在HCT116细胞中,汉黄芩素能够促使p53在细胞质中定位,进而对自噬产生抑制作用;而在HT29细胞中汉黄芩素能够诱导p53定位于胞核,进而对自噬产生促进作用。因此,本研究为汉黄芩素对结直肠癌的化学预防提供了一个新的理论依据。
安佳佳[5]（2014）在《亚硒酸钠通过ROS/JNK/ATF2通路诱导白血病NB4细胞周期阻滞和凋亡的机制研究》文中认为硒是人体内一种必需的微量元素,对身体健康、肿瘤的预防以及治疗都具有重要作用。大量实验表明,超营养剂量的硒可以有效诱导包括前列腺癌、膀胱癌、甲状腺癌、食管癌、肝癌、结肠癌、肺癌及白血病等在内的多种肿瘤细胞发生凋亡。其中,白血病（Leukemia）又称为血癌,是一种造血细胞的恶性增生性疾病,其致死率高,且目前的治疗方案还不尽如人意。因此,研究亚硒酸钠诱导白血病细胞凋亡的分子机制可以为含硒药物的研发以及白血病的治疗提供理论依据,并具有重要意义。本研究以亚硒酸钠为抗肿瘤药物诱导白血病细胞凋亡并探讨该过程的分子生物学机制。首先,我们通过流式细胞术和TUNEL染色实验验证硒可以以时间依赖的方式诱导白血病NB4细胞发生凋亡。与此同时,我们发现硒作用下,白血病细胞的DNA合成能力显着降低,且PI染色结合流式细胞术的方法发现硒可以导致NB4细胞被捕获在G0/G1期。Western blot实验同样证实G0/G1期标志性蛋白在硒作用下发生显着下调且该过程伴随着JNK/ATF2信号通路的失活。在之后的实验中,我们进一步发现活性氧在硒处理NB4细胞后迅速上升,而在硒与活性氧清除剂联用后,硒所引起的细胞凋亡和细胞周期停滞被完全抑制。随后的Western blot实验除了确定活性氧对于细胞凋亡及细胞周期进程相关蛋白的表达及活性调控作用外,还发现JNK/ATF2通路的抑制是活性氧的产生所造成的。进一步免疫共沉淀实验以及间接免疫荧光实验证实JNK与ATF2的确存在相互作用。且特异性抑制剂、siRNA干扰以及组成性活化JNK的实验均发现ATF2的抑制是JNK的失活所致,且活性氧作用下JNK的失活是CDK4、cyclinD3、cyclinA等细胞周期蛋白下调以及细胞凋亡发生的重要原因。在此基础上,染色质免疫共沉淀实验证明了ATF2可以结合在CDK4、cyclinD3和cyclinA的启动子区,且硒作用下ATF2与靶序列的结合明显减弱。siRNA干扰以及ATF2的过表达实验同样发现周期蛋白CDK4、cyclinD3、cyclinA的表达以及凋亡标志性蛋白caspase3和PARP的切割受到ATF2的调控,并最终确定ATF2具有促进NB4细胞周期进程以及抑制细胞凋亡的功能。最后,我们采用CDK4特异性抑制剂与亚硒酸钠联用,通过流式细胞术及western blots实验证明CDK4的失活可加剧亚硒酸钠诱导的NB4细胞凋亡。至此,我们的实验结果发现硒作用NB4细胞后产生活性氧通过抑制JNK/ATF2通路阻断NB4细胞周期进程并借此引发凋亡。最后,我们建立了白血病NB4细胞体外裸鼠异体移植瘤模型。TUNEL实验、HE染色结果显示亚硒酸钠在体内有促进肿瘤细胞死亡的作用。采用免疫组化的方法间接标记人白血病细胞表面抗原—CD33,并在裸鼠的肝和脾中检测CD33阳性细胞的变化情况,结果显示亚硒酸钠在体内具有抑制肿瘤细胞浸润和转移的功能。之后,我们提取了肿瘤组织的全蛋白样品,Western blot实验结果证实JNK/ATF2通路、CDK4、cyclinD3、cyclinA、phosphoRb、PARP和caspase3在体内变化与细胞水平实验结果一致,免疫组化实验同样证实了上述结论。本研究发现了亚硒酸钠可以通过阻滞肿瘤细胞周期的进程进而导致细胞发生凋亡。由于这种机制的上游事件是活性氧,而活性氧正是众多抗肿瘤药物的作用机制,使之具有普遍的意义,同时也为亚硒酸钠用于临床提供了一个较好的理论基础和实验依据;此外,我们通过裸鼠异种移植瘤实验,在动物水平上证实了亚硒酸钠不仅可以诱导肿瘤细胞发生凋亡,亦可以抑制肿瘤细胞的浸润和转移,说明亚硒酸钠对白血病治疗具有潜在的临床应用价值,这也为白血病的治疗提供了理论依据。
纪亚丽[6]（2013）在《斑蝥酸钠对人结直肠癌细胞HCT116和SW480的作用及其机制的研究》文中研究表明[目的]研究斑蝥酸钠对人结直肠癌HCT116和SW480细胞株的抑制作用及可能机制。[方法]1.MTT法检测斑蝥酸钠对人结直肠癌细胞HCT116和SW480增殖的抑制作用并计算其IC50值；2.流式细胞术检测斑蝥酸钠对肿瘤细胞凋亡和细胞周期的影响；3.免疫细胞化学染色检测斑蝥酸钠干预后肿瘤细胞的Bax、Bcl-2、MLH-1、MSH2与p53蛋白的表达情况。[结果]1.HCT116细胞株：斑蝥酸钠作用于指数增殖期的HCT116细胞,MTT法检测其对肿瘤细胞具有增值抑制作用,抑制率与浓度呈正相关,计算其IC50值为1.51±0.01ug/mL;流式细胞术检测斑蝥酸钠能促进肿瘤细胞的凋亡,浓度在0.625ug/ml时细胞开始出现明显的凋亡,凋亡率与药物剂量呈正相关,其对肿瘤细胞细胞周期的影响主要在G2期阻滞,浓度在2.5ug/m1时与对照组比较差异有统计学意义；免疫细胞化学染色检测不同浓度的斑蝥酸钠干预后,Bax、MLH-1、MSH2、P53蛋白表达明显上调,与剂量呈正相关；在浓度为0.625ug/m1时Bcl-2蛋白表达明显下调。2.SW480细胞株：斑蝥酸钠作用于指数增殖期的SW480细胞,MTT法检测其对肿瘤细胞具有增值抑制作用,抑制率与浓度呈正相关,计算其IC50值为2.16±0.04ug/mL;流式细胞术检测斑蝥酸钠能促进肿瘤细胞的凋亡,浓度在1.25ug/ml时细胞开始出现明显的凋亡凋亡率与药物剂量呈正相关,其对肿瘤细胞细胞周期的影响主要在G2期阻滞,浓度在2.5ug/m1时与对照组比较差异有统计学显着性意义；免疫细胞化学染色检测不同浓度的斑蝥酸钠干预后,Bax蛋白表达明显上调,与剂量无明显相关；MLH-1、MSH2、P53蛋白表达明显上调,与剂量呈正相关；在浓度为0.625ug/ml时Bcl-2蛋白表达明显下调。[结论]1.斑蝥酸钠对HCT116和SW480细胞株生长均有较强的抑制作用,且对HCT116细胞抑制作用强于对SW480细胞；2.斑蝥酸钠可通过调节Bax、Bcl-2、MLH-1、MSH2及P53等基因蛋白表达,产生G2/M期阻滞,诱导HCT116细胞和SW480细胞产生促凋亡作用,对HCT116细胞促凋亡作用要强于对SW480细胞。
赵波[7]（2012）在《CEF感染ALV-J后2、3号染色体微卫星不稳定性的研究》文中研究说明微卫星不稳定性（micro satellite instability, MSI）现在已经被公认为是恶性肿瘤形成的一个新机制,人们越来越关注MSI在恶性肿瘤中的临床应用价值。自1993年在遗传性非息肉性结直肠癌（hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC）中发现有较高比例的MsI以来,人类对肿瘤病的微卫星不稳定性的研究已有20年的历史。禽白血病作为鸡的三大肿瘤性疾病之一,到目前为止,除本实验室吴艳婷于2011年用MSI对该病做过早期诊断外,国内外对鸡白血病MSI的报道实属罕见。本实验通过应用J亚群禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus Subgroup J, ALV-J）感染鸡胚成纤维细胞,扩增鸡2、3号染色体上82个微卫星标记并电泳检测,旨在发现发生变化的微卫星位点,有助于临床工作者通过获取外周血、骨髓和内脏器官等样本,用变化位点的组合来对该病的发生做早期诊断,为禽病工作者的诊断提供理论依据。23个无特定病原体（Specific Pathogen Free, SPF）鸡胚的组织,一半作为对照组,另一半用于培养鸡胚成纤维细胞（Chicken Embryo Fibroblast, CEF）。细胞接毒并培养7d且上清液用酶联免疫吸附试验（enzyme linked i mmunosorbent assay, ELISA）检测结果为阳性后,收集细胞。提取鸡胚组织和细胞的DNA,进行PCR扩增,扩增产物用12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染后用凝胶成像系统记录结果,检测接毒细胞基因组的微卫星变化情况。试验结果显示2、3号染色体上的82个微卫星位点,有48个位点发生不同百分率的MSI,占全部微卫星位点的58.54%,还有34个位点用12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法没有检测到变化。检测到有MsI的微卫星位点,表现出不同的变化率,2个位点发生较高的MSI, ABR0579和MCW0220变化率均为30.43%。变化率在20%以上的位点有ABR0520、ABR0569、MCW0311、LEI0223,变化率分别是26.09%,26.09%,21.74%,21.74%。鸡胚成纤维细胞感染禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus, ALV）后的样本有23/23（100.00%）表现出MSI。2号样品,MSI发生率最高为26.83%,其次8号,7号,23号样品MSI发生率分别为19.51%,10.98%,10.98%。其余样品的MSI变化率均在在10%以下。第7组样品的ABR0520位点、第8组样品的ABR0520和ADL0300位点、第15组样品的ABR0587位点的测序结果表明,接毒细胞与组织DNA相比,核心序列中的部分碱基缺失或增加,导致微卫星条带的减小或增大,与PAGE得到的结果保持一致。本研究首次发现鸡胚成纤维细胞感染ALV-J后2、3号染色体上存在多位点的微卫星不稳定性。感染ALV后CEF可出现多个微卫星位点的改变,提示ALV感染CEF早期可能会整合到宿主的多个位点引起基因组的变化。以PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染为基础的微卫星技术可以快速、有效地检测出染色体内部基因组的不稳定性,这为动物肿瘤疾病的研究提供了一个很好的研究模式。
杨健琼[8]（2012）在《马立克氏病患鸡错配修复基因MLH1基因突变和蛋白表达的研究》文中研究指明鸡马立克氏病（Marek’s disease, MD）是由马立克氏病毒（Marek’s disease virus, MDV）引起的一种鸡的恶性淋巴肿瘤疾病,是鸡的三大肿瘤病之一。目前乃至将来相当长的一段时间里它在养鸡业中都具有重要的经济意义。错配修复基因（mismath repair gene, MMR）是细胞内负责对碱基错配进行修复的基因,它们的缺陷会导致肿瘤相关基因的突变不能被及时有效纠正,从而使得宿主易感肿瘤。此类基因中MLH1和MSH2占主要地位,它们的功能是在生理状况下可以表达丰富的蛋白产物来维持基因的稳定性,当其发生突变、缺失或其他改变时,会影响其正常表达,出现错配修复功能障碍,其表现为不能对宿主DNA的碱基的转换和颠换突变进行识别和修复,因而使某些抑癌基因失活或一些肿瘤基因被激活,最终导致宿主细胞凋亡或肿瘤形成。本试验是对健康鸡的MMRMLH1基因以及对患MD鸡的肿瘤组织中的MLH1基因突变情况和蛋白表达情况进行研究。旨在探索鸡的MLH1基因与MD肿瘤发生的关系。试验分两大部分,第一部分是检测了MLH1基因的19对外显子基因突变情况,具体操作是先通过HE染色确定患鸡的肿瘤组织和正常组织,再分别从中提取DNA,以NCBI上公布的MLH1基因DNA序列的19对外显子序列来设计引物,进行PCR扩增,PcR产物进行琼脂糖凝胶电泳,确定为目的条带后,通过PCR-SSCP技术来检测MD同一只鸡的肌肉组织和内脏组织间有无条带的差异,来推测MLH1基因是否存在基因突变。结合SSCP和病理切片结果,提取病灶明显的同一只鸡的肿瘤组织和健康组织的DNA,并以其为模板,MLH1基因的19对外显子引物,进行PCR扩增,经验证条带单一后,扩大PCR体系并将产物纯化后测序分析。用DNAstar软件对正常组织和肿瘤组织的DNA序列测序结果进行比对,寻找确定是否存在核酸层次的改变（碱基改变、插入、缺失等）和氨基酸层次的改变,判定MLH1基因有无基因突变。第二部分用免疫组化染色方法检测MLH1基因在MD肿瘤组织中的蛋白表达情况,鉴别肿瘤细胞的类型。具体做法是将福尔马林固定的肿瘤组织做常规的石蜡切片,分别进行（苏木精伊红）HE和免疫组化（常规IHC和T/B淋巴细胞）染色,检测肿瘤病灶和灶旁组织的MLH1基因表达情况。试验结果为通过PCR-SSCP检测,未检测到有条带的差异,即未检测到MLH1有基因突变。通过HE染色发现2号鸡的肝脏组织呈现结节性病灶,对其提取DNA并进行测序,经过软件DNA star比对后,肝脏肿瘤和健康组织的DNA序列未发现有差异,即从核酸层次也未发现MLH1基因存在基因突变。通过免疫组化方法检测到患有MD的病鸡的肾脏肿瘤组织肿瘤病灶和灶旁组织的MLH1蛋白表达上有差异,瘤旁组织细胞胞浆MLH1基因表达阳性,肿瘤病灶处细胞MLH1基因呈低表达或不表达。通过T/B淋巴细胞免疫组化检测到肾脏的肿瘤细胞是CD3表达阳性染成蓝黑色的的T淋巴细胞,即鸡的马立克氏肿瘤可能是T淋巴细胞瘤。
马琳[9]（2011）在《NSAIDs对Iovo结肠癌细胞株hMLH1、hMSH2及MSI作用的初步研究》文中研究指明目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是世界范围内高发恶性肿瘤,居于世界恶性肿瘤发病率的第三位。因此探讨其发生机制,寻找有效的预防措施以及制定最佳的诊疗方案,将是降低其发病率和死亡率的关键。业已发现,微卫星（Microsatellite,MS）的稳定情况与肿瘤发生关系密切。MS是简单DNA重复序列由1～6个核苷酸串联排列而成的,极易出现聚合酶复制错误。实验证实[1]肿瘤的发生可能存在微卫星不稳定（Microsatellite instability,MSI）和微卫星稳定（microsatellite stable,MSS）不同途径。MSI是指由于DNA复制错误引起简单重复序列的增多或减少,它可以使整个基因组稳定性下降,随机突变率增高,导致一系列肿瘤相关靶基因的改变,引起肿瘤发生。而MSI的发生又与错配修复基因（mismatch repair gene,MMR）关系密切,MMR基因表型改变,尤其是两个关键基因hMLH1（human mut-l homologue 1,hMLH1）和hMSH2（human mut-s homologue 2,hMSH2）的改变可能会导致基因组不稳定而产生MSI,进而促进肿瘤的发生、发展。MMR是DNA修复系统中的重要工具酶,其功能主要为修复错误配对的碱基。MMR超家族有9种错配修复酶,其中以hMSH2和hMLH1功能最重要,二者在很多肿瘤中表达缺失或降低。本实验通过选择hMSH2表达缺失的Lovo细胞株,进而观察药物作用对hMLH1基因和蛋白表达的影响及相关因素分析。有研究发现,DNA局部高甲基化可以引起染色体结构改变,并且促进杂合缺失或等位基因缺失[2]。而MSI结直肠癌中hMLH1蛋白的表达缺失与hMLH1基因启动子CpG岛甲基化有关。研究表明[2],hMLH1启动子CpG岛甲基化引起的蛋白表达缺陷是引起散发性胃肠肿瘤MSI的主要原因。非甾体类抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）是临床上常用的解热镇痛抗炎药,研究发现NSAIDs对结直肠癌具有预防和治疗作用[3]。其机制主要是通过抑制COX-2发挥抗肿瘤作用,还可以通过激活细胞信号转导通路中P38MAPK来诱导肿瘤细胞的凋亡,但对于COX-2低表达的MSI肿瘤,阿斯匹林和舒林酸[4]作用于错配修复酶缺陷的结肠癌细胞株,可显着减少其MSI表型,预防大肠息肉向癌转化,甚至可以逆转早期大肠癌,因此通过影响MMR蛋白表达也是NSAIDs抗肿瘤的另一途径,其机制尚不十分明确。本研究应用非选择性环氧化酶抑制剂吲哚美辛（Indometacin）作用于MSI阳性（hMSH2表达缺失）的人结肠癌lovo细胞株,通过蛋白印迹（Western-blot）、聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）、甲基化特异性聚合酶链反应（Methylation Specific PCR,MSP）等方法,观察药物对lovo细胞增殖、hMLH1、微卫星不稳定性及DNA错配修复基因CpG岛甲基化的影响,初步探讨NSAIDs预防和治疗机制,寻找更有效的分子标志,以期为结直肠癌的发生、治疗及预防提供实验基础和理论依据。方法:1材料:人结肠癌lovo细胞株:MSI阳性（hMSH2表达缺失）;非选择性环氧化酶抑制剂Indometacin。2方法:2.1用甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定各组lovo细胞株的增殖情况,以确定半数抑制浓度（IC50）:设立空白对照组（control）、溶剂对照组（solvent）、药物组;药物浓度为12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L 200μmol/L。作用时间:72h,测定IOD值,计算细胞生长抑制率,根据公式确定IC50。2.2实验分组:2.2.1浓度分组:根据IC50分别选取三个不同浓度,Indometacin:25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L作用于lovo细胞株。2.2.2时间分组:选取药物IC50以下三个浓度作用于lovo细胞株,24h、48h、72h收集细胞。2.3检测指标:2.3.1应用蛋白免疫印迹（Western-blot）的方法检测药物作用不同时间各组细胞hMLH1、hMSH2蛋白的表达情况。2.3.2采用聚合酶链反应（PCR）技术对各组细胞基因组DNA的5个微卫星位点（BAT-25, BAT-26, D2S123, D5S346, D17S250）进行扩增,检测MSI情况。2.3.3采用甲基化特异性聚合酶链反应（Methylation Specific PCR,MSP）技术对各组细胞基因组DNA中hMLH1和hMSH2启动子CpG岛进行扩增,检测二种基因启动子甲基化状态及变化。结果:1 Indometacin对lovo细胞株增殖的影响Indometacin作用于lovo细胞72h,IC50为104.23μmol/L。Indometacin可抑制lovo细胞增殖,并且随着药物浓度的增加,抑制作用逐渐增强。溶剂对细胞生长未见明显影响。2 Western-blot检测对lovo细胞hMLH1和hMSH2蛋白的影响hMLH1、hMSH2蛋白分子量分别为85kD、110kD,Western杂交后于相应位置出现阳性条带。采用凝胶成像分析系统对条带进行半定量分析,蛋白含量以IOD表示,以β-actin蛋白做为内参,以相对积分光密度比较蛋白表达高低。Indometacin对hMLH1蛋白表达影响随药物作用时间延长其作用逐渐增强,在作用于lovo细胞72h后,hMLH1蛋白表达量增高明显（P<0.05）。lovo细胞hMSH2在药物作用前后均未见表达。3微卫星不稳定检测结果（1）BAT-25检测结果BAT-25DNA终产物大小为～90bp,PCR产物行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后于相应位置出现阳性条带。采用凝胶成像分析系统对条带进行半定量分析,DNA含量以IOD表示,以18s为内参,以相对积分光密度比较基因DNA表达高低。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-25DNA产物IOD值分别为（0.70±0.01）、（0.63±0.02）和（0.52±0.01）,明显低于对照组（0.98±0.01）（p<0.05）。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-25DNA产物IOD值分别为（0.60±0.03）、（0.52±0.01）和（0.37±0.01）,明显低于对照组（0.98±0.01）（p<0.05）。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-25DNA产物IOD值分别为（0.47±0.02）、（0.38±0.02）和（0.23±0.02）,明显低于对照组（0.98±0.01）（p<0.01）。其各浓度组之间差异亦有统计学意义（p<0.05）。随着药物浓度的增加,BAT-25表达逐渐减少,尤以48h减少最为明显。（2） BAT-26检测结果BAT-26DNA终产物大小为80～100bp。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-26DNA产物IOD值分别为（1.20±0.03）、（1.00±0.02）和（0.77±0.03）,明显低于对照组（1.33±0.02）（p<0.05）。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-26DNA产物IOD值分别为（1.08±0.03）、（0.92±0.02）和（0.75±0.03）,明显低于对照组（1.33±0.02）（p<0.05）,其中72h有显着差异（p<0.01）。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,BAT-26DNA产物IOD值分别为（0.97±0.02）、（0.75±0.02）和（0.29±0.03）,明显低于对照组（1.33±0.02）（p<0.05）。其各浓度组之间差异亦有统计学意义（p<0.05）。随着药物浓度的增加,BAT-26表达逐渐减少,尤以24h减少趋势最明显。（3） D2S123检测结果D2S123DNA终产物大小为197～227bp。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D2S123DNA产物IOD值分别为（0.79±0.03）、（0.65±0.03）和（0.46±0.02）,明显低于对照组（1.12±0.01）（p<0.05）。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D2S123DNA产物IOD值分别为（0.69±0.02）、（0.41±0.02）和（0.30±0.02）,明显低于对照组（1.12±0.01）（p<0.05）。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D2S123DNA产物IOD值分别为（0.62±0.01）、（0.35±0.02）和（0.19±0.01）,明显低于对照组（1.12±0.01）（p<0.05）。其各浓度组之间差异亦有统计学意义（p<0.05）。随着药物浓度的增加,D2S123表达逐渐减少,尤以48h减少趋势最明显。（4） D5S346检测结果D5S346DNA终产物大小为96～122bp。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D5S346DNA产物IOD值分别为（0.95±0.01）、（0.87±0.02）和（0.73±0.01）,明显低于对照组（1.05±0.01）（p<0.05）。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D5S346DNA产物IOD值分别为（0.85±0.02）、（0.71±0.02）和（0.63±0.01）,明显低于对照组（1.05±0.01）（p<0.05）。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D5S346DNA产物IOD值分别为（0.79±0.02）、（0.67±0.01）和（0.46±0.01）,明显低于对照组（1.05±0.01）（p<0.05）。其各浓度组之间差异亦有统计学意义（p<0.05）。随着药物浓度的增加,D5S346表达逐渐减少,尤以48h减少最为明显。（5） D17S250检测结果D17S250DNA终产物大小为～150bp。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D17S250DNA产物IOD值分别为（0.93±0.02）、（0.71±0.03）和（0.44±0.03）,明显低于对照组（1.07±0.02）（p<0.05）。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D17S250DNA产物IOD值分别为（0.76±0.02）、（0.68±0.02）和（0.31±0.02）,明显低于对照组（1.07±0.02）（p<0.05）。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,D17S250DNA产物IOD值分别为（0.72±0.01）、（0.54±0.02）和（0.27±0.03）,明显低于对照组（1.07±0.02）（p<0.05）。其各浓度组之间差异亦有统计学意义（p<0.05）。随着药物浓度的增加,D17S250表达逐渐减少,尤以24h减少趋势最明显。4 hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化检测结果hMLH1, hMSH2基因启动子CpG岛甲基化DNA终产物分别为115bp、132bp,CpG岛非甲基化DNA终产物分别为124bp、137bp,MSP产物行琼脂糖凝胶电泳后于相应位置出现阳性条带。采用凝胶成像分析系统对条带进行半定量分析,DNA含量以IOD表示,以18s为内参,以相对积分光密度比较基因DNA表达高低。Indometacin作用前后,hMLH1基因启动子CpG岛均有甲基化DNA产物,非甲基化DNA产物阴性;hMSH2基因启动子CpG岛均为非甲基化DNA产物,甲基化DNA产物阴性。Indometacin以25μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,hMLH1基因启动子CpG岛甲基化DNA产物IOD值分别为（0.88±0.03）、（0.78±0.03）和（0.69±0.02）,明显低于对照组（0.94±0.01）（p<0.05）。以50μmol/L作用于lovo细胞24h、48h、72h后,hMLH1基因启动子CpG岛甲基化DNA产物IOD值分别为（0.69±0.03）、（0.66±0.03）和（0.60±0.02）,明显低于对照组（0.99±0.01）（p<0.05）。以IC50作用于lovo细胞24h、48h、72h后,hMLH1基因启动子CpG岛甲基化DNA产物IOD值分别为（0.51±0.02）、（0.46±0.03）和（0.38±0.02）,明显低于对照组（0.96±0.02）（p<0.01）。其各浓度组之间差异亦有统计学意义（p<0.05）。随着药物浓度的增加,hMLH1基因启动子CpG岛甲基化频率逐渐降低,尤以24h降低最为明显。结论:1 Indomethacin对人结肠癌lovo细胞株生长的抑制作用呈时间和剂量依赖性。2 Indomethacin可以促进lovo细胞株hMLH1蛋白表达。3随着Indomethacin作用时间及浓度的增加hMLH1 CpG岛甲基化水平明显降低,MSI五个位点BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346、D17S250表型减少。Indomethacin可通过hMLH1基因启动子CpG岛去甲基化,恢复hMLH1功能,减少MSI发生。4 lovo细胞株hMSH2蛋白表达缺失与其基因启动子CpG岛甲基化无关。
徐艳松[10]（2009）在《广西散发性结直肠癌错配修复基因hMLH1突变研究》文中研究说明背景与目的结直肠癌是最常见的人类恶性肿瘤之一,结直肠癌发病率在不断上升,而且在高发城市如上海市已高居恶性肿瘤的第2位,大量研究表明结直肠癌是由基因突变引起的。而基因突变由致癌剂引起,也可由DNA代谢过程中产生的碱基错配引起。为了确保遗传物质的完整和稳定,细胞有许多防止基因突变的系统,其中包括切除修复、直接修复、重组修复和错配修复（mismatch repair,MMR）。MMR系统不仅通过矫正在DNA重组和复制过程中产生的碱基错配而保持基因组的稳定性,而且通过诱导DNA损伤细胞的凋亡而消除由突变细胞生长形成的癌变。人类错配修复基因包括hMSH2、hMLH1、hMSH3、hPMH1、hPMH2等,其中起主要作用的是hMSH2、hMLH1基因。聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-Single Strand Conformation polymorphism,PCR-SSCP）分析技术是在1989年由Orita等创立的一种筛查突变的新技术。由于该方法是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段,在肿瘤研究领域被广泛应用。本研究的目的是通过利用PCR-SSCP结合DNA测序方法检测散发性结直肠癌（sporadiccolorectal carcinoma,SCC）患者错配修复基hMLH1的突变情况,并分析hMLH1基因与结直肠癌临床病理之间的关系,探讨hMLH1基因在散发性结直肠癌发生、发展中的作用。方法以酚/氯仿提取法提取散发性结直肠癌患者的癌组织及癌旁组织DNA（n=44）,采用PCR方法扩增hMLH1基因第8、12、14、15、16外显子,PCR反应体系组成及终浓度:模板DNA2.5μl,10×buffer 5.0μl（25mmol/LMgcl2）,0.2μM上下游引物各1μl,2.5 mmol/l dNTPS 4μl,1U/μl TaqDNA聚合酶0.5μl,双蒸水36μl,反应总体系为50μl。循环条件:预热94℃3分钟,变性94℃30秒,退火55-63℃30秒,延伸72℃45秒,共30个循环的扩增,最后72℃延伸5分钟。通过单链构象多态性分析结合银染色的方法找出异常条带,有异常条带的PCR产物纯化后直接进行DNA序列测序。结果44例结直肠癌标本中,有1例标本的SSCP图片出现异常泳动条带,经DNA正反双向测序证实为突变,突变率为2.3%,突变类型为错义突变,codon581（CCG→CTG,Pro→Leu）。结论本课题研究提示广西散发性结直肠癌中存在hMLH1基因突变,但hMLH1基因突变可能是散发性结直肠癌的发生、发展过程中的一个偶发事件。
二、Inhibitory Effect of Sodium Selenite on Microsatellite Instability of RER~+ Colorectal Cancer Cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Inhibitory Effect of Sodium Selenite on Microsatellite Instability of RER~+ Colorectal Cancer Cells（论文提纲范文）
（1）苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献研究 |
| 祖国医学部分 |
| 1. 祖国医学对肿瘤的认识(历史沿革) |
| 2. 祖国医学对结直肠癌的认识 |
| 2.1 祖国医学对结直肠癌疾病的认识 |
| 2.2 祖国医学对结直肠癌病因病机的认识 |
| 2.3 祖国医学对结直肠癌证型的认识 |
| 2.4 祖国医学对结直肠癌辨病、辩证治疗的认识 |
| 2.5 祖国医药抗结直肠肿瘤的优势 |
| 2.6 中药治疗结直肠癌的研究进展 |
| 3. 中药苦豆子及其成分苦豆碱的研究进展 |
| 3.1 中药苦豆子的研究进展 |
| 3.2 苦豆碱的药理学作用及其机制研究进展 |
| 现代医学部分 |
| 1 现代医学对结直肠癌病因及机制的研究 |
| 1.1 结直肠癌分子标志物 |
| 1.2 结直肠癌相关信号通路 |
| 2 microRNAs与结直肠癌的研究进展 |
| 2.1 microRNAs与结直肠癌相关机制研究 |
| 2.2 microRNAs在结直肠癌临床应用 |
| 3 结直肠癌EMT的研究进展 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一部分 ALO抑制结直肠癌细胞增殖 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞株的培养 |
| 2.2 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.3 MTT实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 不同浓度ALO对不同结直肠癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.2 ALO对不同结直肠癌细胞的IC50 |
| 4. 总结 |
| 第二部分 ALO对miR-296-5p在结直肠癌细胞中表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 利用生物信息网站StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 2.3 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 2.4 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 StarBasev3.0分析miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p在不同人结直肠癌细胞及人肠上皮细胞中的表达 |
| 3.3 qRT-PCR检测ALO处理后SW480和HCT116细胞miR-296-5p的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三部分 STAT3和miR-296-5p存在结合位点 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 TargetScan V7.2靶基因预测 |
| 2.3 野生型(WT)和突变型(MUT)-STAT3 3'UTR片段设计和合成 |
| 2.4 质粒的建立、提取及鉴定 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 生物信息学网站TargetScan V7.2显示STAT3是miR-296-5p的靶基因 |
| 3.2 miR-296-5p mimics能够抑制STAT3-荧光素酶活性 |
| 3.3 miR-296-5p inhibitor增强STAT3-荧光素酶活性 |
| 4. 总结 |
| 第四部分 ALO和miR-296-5p对结直肠癌细胞STAT3表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 ALO处理结直肠癌细胞 |
| 2.4 qRT-PCR实验 |
| 2.5 Western blot实验 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 qRT-PCR检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等不同处理后HCT116细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.2 qRT-PCR检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等处理后SW480细胞中miR-296-5p的表达 |
| 3.3 Western blot检测miR-296-5p mimics、STAT3过表达、ALO等处理后HCT116细胞中STAT3的表达 |
| 3.4 Western blot检测miR-296-5p inhibitor、siSTAT3、ALO等不同处理后SW480细胞STAT3的表达 |
| 4. 总结 |
| 第五部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞增殖和凋亡 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 细胞克隆形成实验(Clone formation assay) |
| 2.4 细胞凋亡检测(Cell apoptosis detection) |
| 2.5 Western-blot检测细胞凋亡相关蛋白 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞增殖 |
| 3.2 克隆形成实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.3 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞凋亡 |
| 3.4 细胞凋亡实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞增殖 |
| 3.5 HCT116细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 3.6 SW480细胞凋亡相关蛋白的检测 |
| 4. 总结 |
| 第六部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控结直肠癌细胞迁移和侵袭 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 划痕愈合实验 |
| 2.4 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞迁移 |
| 3.2 划痕愈合实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞迁移 |
| 3.3 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控HCT116细胞侵袭 |
| 3.4 Transwell细胞侵袭实验验证ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控SW480细胞侵袭 |
| 4. 总结 |
| 第七部分 ALO通过调节miR-296-5p/STAT3通路调控EMT相关蛋白的表达 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验主要试剂和耗材 |
| 1.3 实验主要仪器设备 |
| 1.4 实验常用试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 结直肠癌细胞(SW480、 HCT116)的培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 Western blot实验 |
| 3. 结果 |
| 3.1 Western blot检测HCT116细胞EMT相关蛋白N-cadherin(N-cad)和E-cadherin(E-cad)的表达 |
| 3.2 Western blot检测SW480细胞EMT相关蛋白N-cadherin (N-cad)和E-cadherin (E-cad)的表达 |
| 4. 总结 |
| 第三章 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）用于癌症预防药物研究的烟草诱导细胞恶性转化模型的建立与初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 一、细胞体外转化实验研究现状 |
| 二、吸烟与癌症相关性的研究进展 |
| 三、癌症化学预防有效单体研究现状 |
| 1. 姜黄素 |
| 2. 阿司匹林与水杨酸 |
| 3. 硒 |
| 4. 阿魏酸 |
| 四、TGF-β通路与癌症发生的关系研究 |
| 五、百合固金方的现代研究概况 |
| 1. 方解及现代临床应用 |
| 2. 处方中药物现代研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 香烟主流烟气冷凝物诱导Bhas 42细胞恶性转化模型的建立及评价 |
| 第一节 香烟主流烟气冷凝物(CSC)的制备及其稳定性评价 |
| 第二节 CSC诱导Bhas 42细胞转化实验模型的建立 |
| 第三节 CSC诱导Bhas 42细胞转化实验的机制研究 |
| 第四节 基于CSC诱导Bhas 42细胞恶性转化模型研究癌症预防药物的可行性验证 |
| 本章总结与讨论 |
| 第二章 百合固金方癌症预防作用的初步研究 |
| 第一节 基于细胞转化模型筛选百合固金方中的有效药味及配伍 |
| 第二节 基于CSC诱导Bhas 42细胞转化模型筛选癌症预防药物的可靠性验证 |
| 本章总结与讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）HOXA10蛋白上调对结直肠癌预后的指导意义（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 HOXA10蛋白表达与结直肠癌临床病理特征及预后的相关性研究 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HOXA10基因在结直肠癌细胞中的功能研究 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 miR-135a调控HOXA10影响5-Fu化疗敏感性的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述1 氟尿嘧啶类药物在结直肠癌应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述2 同源框基因在消化道肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（4）汉黄芩素调控P53核转位干预结直肠癌的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 结直肠癌流行病学 |
| 1.2 结直肠癌的发病机理 |
| 1.3 活性氧与肿瘤 |
| 1.4 自噬与肿瘤 |
| 1.5 P53与肿瘤 |
| 1.6 结直肠癌动物模型 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 第二章 汉黄芩素抑制结直肠癌细胞增殖、调节自噬与凋亡 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人结肠腺癌细胞培养 |
| 2.2.2 细胞增殖活力研究 |
| 2.2.3 汉黄芩素对结直肠癌细胞克隆形成影响 |
| 2.2.4 汉黄芩素对结直肠癌细胞自噬和凋亡的影响 |
| 2.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 汉黄芩素抑制HCT116和HT29细胞增殖活力 |
| 2.3.2 汉黄芩素调节HCT116和HT29细胞自噬水平 |
| 2.3.3 汉黄芩素调节HCT116和HT29细胞凋亡水平 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 汉黄芩素对结直肠癌细胞活性氧的调节作用 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 结肠癌细胞活性氧检测 |
| 3.2.2 使用Real-time PCR检测汉黄芩素对AKR1B1基因的影响 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 汉黄芩素对两种细胞AKR1B1基因表达的作用 |
| 3.3.2 汉黄芩素促进HCT116细胞AKR1B1蛋白表达 |
| 3.3.3 汉黄芩素诱导HCT116细胞产生ROS |
| 3.3.4 汉黄芩素抑制HT29细胞产生ROS |
| 3.3.5 NAC抑制由汉黄芩素引起的ROS水平 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 汉黄芩素调节结直肠癌细胞内质网应激和DNA损伤 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 细胞种板及给药 |
| 4.2.3 使用Real-time PCR检测汉黄芩素对DDIT3和XBP1基因的影响 |
| 4.2.4 Western blot检测内质网应激和DNA damage通路关键蛋白表达水平的影响 |
| 4.2.5 碱性彗星实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 汉黄芩素对HCT116和HT29细胞内质网应激蛋白水平的调节作用 |
| 4.3.2 汉黄芩素对HCT116和HT29细胞内质网应激基因水平的调节作用 |
| 4.3.3 汉黄芩素对HCT116和HT29细胞DNA-Damage的调节作用 |
| 4.3.4 彗星拖尾检测DNA损伤程度 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 汉黄芩素对结肠癌细胞P53核转位的影响 |
| 引言 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验药品和细胞 |
| 5.1.2 实验试剂耗材 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 用Western blot方法检测P53相关蛋白的表达 |
| 5.2.2 汉黄芩素对结肠癌细胞P53 (ser15)胞浆胞核定位的影响 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 汉黄芩素对结肠癌细胞P53及其磷酸化蛋白表达水平的影响 |
| 5.3.2 汉黄芩素对结肠癌细胞P53及其磷酸化蛋白在胞浆胞核中表达水平的影响 |
| 5.3.3 汉黄芩素对结肠癌细胞P53(ser15)在胞浆胞核中表达水平的影响 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 汉黄芩素对C57BL/6小鼠结直肠癌化学预防作用 |
| 引言 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 炎症性结直肠癌小鼠模型的建立与给药 |
| 6.2.2 实验动物解剖与取材 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 汉黄芩素在C57BL/6 AOM/DSS结直肠癌模型中的化学预防作用 |
| 6.3.2 汉黄芩素在C57BL/6 AOM/DSS结直肠癌模型中的作用机制 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（5）亚硒酸钠通过ROS/JNK/ATF2通路诱导白血病NB4细胞周期阻滞和凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 白血病致病机制及治疗概述 |
| 2. 硒对肿瘤的预防和治疗作用 |
| 3. 细胞凋亡 |
| 4. 活性氧与细胞凋亡 |
| 5. JNK/ATF2通路 |
| 6. 研究目的、内容和意义 |
| 6.1. 研究目的 |
| 6.2. 研究内容 |
| 6.3. 研究意义 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1. 细胞株 |
| 1.2. 菌株和质粒 |
| 1.3. 主要试剂 |
| 1.4. 使用的抗体 |
| 1.5. 靶基因siRNA序列 |
| 1.6. ChIP实验所用引物 |
| 1.7. 主要溶液的配制 |
| 1.8. 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. 细胞的复苏、冻存和培养 |
| 2.2. Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术凋亡检测 |
| 2.3. TUNEL检测细胞凋亡(悬浮细胞) |
| 2.4. TUNEL检测细胞凋亡(免疫组化) |
| 2.5. BrdU掺入-PI/BrdU抗体双染法考察细胞内DNA合成能力 |
| 2.6. PI染色流式细胞术检测细胞周期分布时相 |
| 2.7. Western Blot |
| 2.8. DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧 |
| 2.9. 免疫共沉淀 |
| 2.10. 免疫细胞化学染色 |
| 2.11. 细胞转染方法(RNAi和质粒的转染) |
| 2.12. 细菌的转化和质粒的提取 |
| 2.13. 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 2.14. 裸鼠致瘤实验中脏器及肿瘤组织石蜡块制备和切片方法 |
| 2.15. HE染色 |
| 2.16. 免疫组织化学染色(EnVision法) |
| 2.17. 统计分析 |
| 实验结果 |
| 1. 亚硒酸钠诱导白血病细胞周期阻滞和凋亡 |
| 1.1. 亚硒酸钠可以诱导白血病NB4细胞凋亡 |
| 1.2. 亚硒酸钠抑制白血病NB4细胞DNA合成能力 |
| 1.3. 亚硒酸钠诱使白血病NB4细胞周期阻滞 |
| 1.4. Western blot实验检测亚硒酸钠作用NB4细胞后蛋白变化情况 |
| 2. ROS为亚硒酸钠诱导NB4细胞周期凋亡的上游 |
| 2.1. 流式细胞术和TUNEL法检测ROS对细胞凋亡的影响 |
| 2.2. 确定亚硒酸钠作用细胞后产生的ROS对细胞周期的影响 |
| 2.3. Western blot实验验证活性氧对细胞周期及细胞凋亡的调控 |
| 3. JNK/ATF2通路调控了亚硒酸钠诱导的细胞周期阻滞和凋亡 |
| 3.1 JNK与ATF2存在相互作用 |
| 3.2. 抑制JNK通路可加剧亚硒酸钠诱导的NB4细胞凋亡 |
| 3.3. JNK通路的激活可抑制亚硒酸钠诱导的NB4细胞凋亡 |
| 4. ATF2调控细胞周期相关蛋白的表达并抑制细胞凋亡 |
| 4.1. ChIP实验证实ATF2结合细胞周期相关蛋白的启动子 |
| 4.2. ATF2对细胞周期相关蛋白及凋亡的调控 |
| 4.3. 抑制细胞周期相关蛋白促进亚硒酸钠诱导的NB4细胞凋亡 |
| 5. 亚硒酸钠可以抑制裸鼠异种移植瘤的生长及转移 |
| 5.1. 亚硒酸钠在体内促进肿瘤细胞凋亡 |
| 5.2. 亚硒酸钠可抑制肿瘤细胞的浸润转移 |
| 5.3. 亚硒酸钠在体内抑制JNK/ATF2通路诱导凋亡 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 研究生在读期间参加学术活动、发表论文情况 |
（6）斑蝥酸钠对人结直肠癌细胞HCT116和SW480的作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 结直肠癌的现代研究 |
| 1.1 肿痈的发生发展 |
| 1.2 结直肠癌的发生机制 |
| 1.3 中医药在结直肠癌中的应用 |
| 2 “有毒”中药斑蝥及斑蝥酸钠对肿瘤的作用 |
| 2.1 祖国医学对“以毒攻毒”的认识 |
| 2.2 祖国医学对斑蝥的认识 |
| 2.3 斑蝥酸钠的现代研究 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 噻唑蓝比色法(MTT法)检测斑蝥酸钠对不同途径结直肠癌细胞增殖的抑制作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 ANNEXIN V-FITC双染色法流式检测早期凋亡的肿瘤细胞 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 流式细胞术检测肿瘤细胞周期变化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 统计学处理 |
| 4 免疫细胞化学染色分别检测肿瘤细胞BAX、BCL-2、MLH-1、MSH2与P53蛋白的表达情况 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 斑蝥对肿瘤的抑制作用 |
| 2 斑蝥酸钠对人结直肠癌HCT116细胞与SW480细胞的增殖抑制作用 |
| 3 斑蝥酸钠对人结直肠癌细胞HCT116和SW480细胞周期、细胞凋亡及相关基因的表达的影响 |
| 3.1 对细胞周期及细胞凋亡的影响 |
| 3.2 SCA对相关基因表达的影响 |
| 4 总结 |
| 第四部分 结论 |
| 第五部分 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间取得的学术成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）CEF感染ALV-J后2、3号染色体微卫星不稳定性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文中所引部分缩略语 |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 禽白血病综述 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病毒的分类 |
| 1.2 病毒的结构 |
| 1.3 禽白血病病毒的复制和培养 |
| 1.4 对理化因素的抵抗力 |
| 1.5 抗原变异 |
| 2 流行病学 |
| 3 病理学 |
| 4 诊断 |
| 4.1 病毒分离与鉴定 |
| 4.2 病毒免疫学检测方法 |
| 参考文献 |
| 第二章 微卫星不稳定性及其在肿瘤上的研究 |
| 1 微卫星 |
| 1.1 微卫星的构成 |
| 1.2 微卫星的特点 |
| 1.3 微卫星DNA的检测方法及应用 |
| 2 微卫星不稳定性 |
| 2.1 概念 |
| 2.2 微卫星不稳定性的产生机制 |
| 2.3 微卫星不稳定性的表现类型 |
| 3 DNA错配修复系统及相关基因 |
| 3.1 概念 |
| 3.2 DNA错配修复系统相关基因 |
| 3.3 错配修复基因的作用机制 |
| 3.4 MSI的肿瘤发生机制 |
| 4 微卫星不稳定性在肿瘤上的研究 |
| 4.1 微卫星不稳定性在人类肿瘤上的研究 |
| 4.2 微卫星不稳定性在鸡肿瘤上的研究 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验研究 |
| 第三章 鸡胚成纤维细胞的培养及病毒感染 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 试验样品的选择 |
| 3.2 ELISA检测的有效性 |
| 参考文献 |
| 第四章 CEF感染ALV-J后2、3号染色体微卫星不稳定性的研究 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 部分微卫星位点的变性聚丙烯酰酰胺凝胶电泳结果 |
| 2.2 不同微卫星位点不稳定性统计结果 |
| 2.3 不同样品微卫星不稳定性统计结果 |
| 2.4 发生MSI的位点的序列比对结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 微卫星不稳定性发生的原因 |
| 3.2 微卫星不稳定性发生率与位点有关 |
| 3.3 微卫星不稳定性与肿瘤发生 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（8）马立克氏病患鸡错配修复基因MLH1基因突变和蛋白表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文中所引部分缩略词 |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 鸡马立克氏病综述 |
| 1 病原及其生物学特性 |
| 2 MD的发病机制 |
| 2.1 MD分子水平的发病机制 |
| 2.2 宿主免疫反应对MD发病的影响 |
| 2.3 与MDV致瘤性相关的基因 |
| 2.4 MD肿瘤的靶细胞 |
| 3 流行病学 |
| 4 MD症状 |
| 5 MD病理剖检变化 |
| 6 MD病理组织学变化 |
| 7 MD诊断 |
| 8 MD的防控 |
| 参考文献 |
| 第二章 错配修复基因综述 |
| 1 错配修复基因概念 |
| 2 错配修复基因的种类 |
| 3 MMR突变机制与肿瘤发生 |
| 3.1 人类MMRS的作用机制 |
| 4 MMR的检测方法 |
| 4.1 微卫星不稳定性(MSI)检测 |
| 4.2 PCR-SSCP |
| 4.3 变性梯度凝胶电泳(DGGC) |
| 4.4 变性高效液相色谱法(DHPLC) |
| 4.5 体外藕联的转录翻译反应技术(IVTT) |
| 参考文献 |
| 下篇 试验部分 |
| 第三章 MD肿瘤组织中错配修复基因MLH1基因突变的检测 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 石蜡病理组织切片结果 |
| 2.2 MLH1外显子琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 2.3 PCR-SSCP结果 |
| 2.4 MLH1外显子测序结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第四章 马立克肿瘤组织中错配修复基因MLH1蛋白表达的检测 |
| 摘要 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果与分析 |
| 2.1 即用型非生物素免疫组化EliVisionTMplus检测试剂盒检测结果 |
| 2.2 T/B细胞淋巴瘤免疫组化双染诊断试剂盒检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 MD肿瘤细胞 |
| 3.2 MMR与IHC |
| 3.3 基因突变与IHC |
| 3.4 IHC常见问题及解决办法 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录 试验配液 |
| 致谢 |
（9）NSAIDs对Iovo结肠癌细胞株hMLH1、hMSH2及MSI作用的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 NSAIDs、MMR、MSI 与胃肠道恶性肿瘤 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）广西散发性结直肠癌错配修复基因hMLH1突变研究（论文提纲范文）
| 一、论文部分:广西散发性结直肠癌错配修复基因hMLH1突变研究 |
| 1、中文摘要 |
| 2、英文摘要 |
| 3、缩略词表 |
| 4、前言 |
| 5、实验材料 |
| 6、实验方法 |
| 7、实验结果 |
| 8、讨论 |
| 9、结论 |
| 10、小结 |
| 11、附图 |
| 12、参考文献 |
| 13、致谢 |
| 二、综述部分:错配修复基因的研究进展 |
| 1、综述正文 |
| 2、参考文献 |
四、Inhibitory Effect of Sodium Selenite on Microsatellite Instability of RER~+ Colorectal Cancer Cells（论文参考文献）
- [1]苦豆碱通过调节miR-296-5p/STAT3轴抑制结直肠癌细胞的增殖和转移及其机制研究[D]. 韩玮. 南京中医药大学, 2021(01)
- [2]用于癌症预防药物研究的烟草诱导细胞恶性转化模型的建立与初步评价[D]. 彭宇. 北京中医药大学, 2018(09)
- [3]HOXA10蛋白上调对结直肠癌预后的指导意义[D]. 袁媛. 南京医科大学, 2018(04)
- [4]汉黄芩素调控P53核转位干预结直肠癌的作用机制[D]. 王浩甲. 广州中医药大学, 2017(07)
- [5]亚硒酸钠通过ROS/JNK/ATF2通路诱导白血病NB4细胞周期阻滞和凋亡的机制研究[D]. 安佳佳. 北京协和医学院, 2014(11)
- [6]斑蝥酸钠对人结直肠癌细胞HCT116和SW480的作用及其机制的研究[D]. 纪亚丽. 南京中医药大学, 2013(05)
- [7]CEF感染ALV-J后2、3号染色体微卫星不稳定性的研究[D]. 赵波. 南京农业大学, 2012(01)
- [8]马立克氏病患鸡错配修复基因MLH1基因突变和蛋白表达的研究[D]. 杨健琼. 南京农业大学, 2012(01)
- [9]NSAIDs对Iovo结肠癌细胞株hMLH1、hMSH2及MSI作用的初步研究[D]. 马琳. 河北医科大学, 2011(10)
- [10]广西散发性结直肠癌错配修复基因hMLH1突变研究[D]. 徐艳松. 广西医科大学, 2009(10)