ω-3多不饱和脂肪酸甘油酯富集的研究

论文摘要

鱼油中ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3PUFA）在人体中具有重要的生物学意义,其特征脂肪酸EPA和DHA的生理活性己经明确,EPA具有预防冠心病、降血压、消除疲劳、预防动脉粥样硬化和脑血栓、抗癌等生理活性,DHA能显著地促进婴儿的智力发育,改善大脑机能,提高记忆力,是生产预防心血管疾病和婴儿益智食品的良好基料。前期研究证明ω-3PUFA甘油酯产品在消化吸收和利用方面优于其乙酯和游离型产品,但天然鱼油中ω-3PUFA甘油酯的含量偏低,影响了产品的保健功效,为了提高产品中ω-3PUFA甘油酯的纯度和浓度,提升产品的功能保健价值,本文以甘油和鱼油经水解后分离纯化出来的ω-3PUFA为原料,通过脂肪酶在有机相中催化合成ω-3PUFA甘油酯产品,达到富集ω-3PUFA甘油酯的目的。本论文首先对鱼油水解样中的ω-3PUFA（EPA、DHA）的分析检测和定量方法进行研究,并与国标气相色谱测定方法进行比较,确定了EPA、DHA的HPLC定量分析条件:色谱柱Sunfire-C18（5μm,250mm×4.6mm i.d）;PDA检测波长205nm;流动相为甲醇-0.2%甲酸水溶液体系;洗脱方式为二元梯度洗脱;柱温35℃,进样量5μL。然后对鱼油的水解工艺以及水解后游离ω-3PUFA（EPA、DHA）的分离纯化进行研究,比较了化学水解和酶催化水解两种水解方式,发现化学水解在水解率和EPA、DHA得率上都优于酶水解,化学水解优化的工艺条件为:皂化时间60min,皂化温度50℃,乙醇/水比例（v/v）6:1;振荡频率150r/min,此条件下水解率为95.5%,EPA得率为91.2%,DHA得率为88.9%。鱼油水解后,利用C18柱对水解液进行层析分离纯化,适宜的分离条件为:流动相为甲醇/水,70%、80%、90%、100%甲醇梯度洗脱,流速2mL/min,上样量为2g鱼油水解液,每管10mL进行分部收集,并采用质谱检测对层析样品进行快速分析,利用HPLC检验EPA、DHA收集液的纯度,经分离纯化后EPA、DHA纯度分别达到92.9%和93.2%。随后利用甘油和分离纯化得到的EPA/DHA作为合成反应原料,对有机相脂肪酶催化合成ω-3PUFA甘油酯的间歇生产工艺进行了优化研究。通过单因素实验,确定了有机相脂肪酶催化合成EPA/DHA甘油酯的间歇反应最佳工艺条件:反应溶剂为正己烷,EPA/DHA的浓度为0.2mol/L,EPA/DHA与甘油摩尔比为3:1,分子筛添加在反应进行了24h时,脂肪酶添加量为17g/L,40℃振荡水浴反应48h,经反应合成后,EPA甘油酯的酯化率达到95%,其中甘油三酯含量达93.3%,DHA甘油酯的酯化率为94.5%,其中甘油三酯含量为93.2%,取得了较好的富集效果。通过质谱及1H-NMR、13C-NMR的检测,验证了合成产物EPA甘油三酯和DHA甘油三酯的结构。最后,为了提高化学合成效率,自行设计并组装了一个小型的连续化合成反应装置,初步研究了EPA/DHA甘油酯的连续化生产工艺,探讨了在连续化合成反应过程中脱水装置加入与否、EPA/DHA与甘油的摩尔比、酶催化反应的温度、反应液在酶柱中的滞留时间等因素对产物生成的影响,结果表明,选用1,4-二氧六环溶剂,ω-3PUFA（EPA、DHA）甘油酯的连续化合成在反应温度45℃,EPA/DHA与甘油摩尔比为3:1,反应底物在酶柱中滞留时间为2h的工艺条件下,EPA和DHA甘油酯的酯化率分别为31.4%和29.7%,甘油三酯含量分别为9.3%和8.8%。ω-3PUFA甘油酯连续化合成反应的初步研究结果显示,连续化工艺尽管在反应效率上大幅度提高,对于工业化生产应用有一定参考价值,但是在如何提高甘油三酯产率问题还有待于进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 EPA 和 DHA 的生理功能
• 1.2.1 增进神经系统功能，益智健脑
• 1.2.2 抑制血栓，预防心肌梗塞和脑梗塞
• 1.2.3 降血脂和胆固醇，预防和治疗动脉粥样硬化
• 1.2.4 降血压
• 1.2.5 抑制肿瘤
• 1.3 EPA、DHA 的富集方法
• 1.3.1 传统理化方法富集
• 1.3.1.1 低温冷冻法
• 1.3.1.2 金属盐沉淀法
• 1.3.1.3 尿素包合法
• 1.3.1.4 分子蒸馏法
• 1.3.1.5 超临界气体萃取法
• 1.3.1.6 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.3.2 酶法富集
• 1.3.2.1 脂肪酶选择性水解法
• 1.3.2.2 脂肪酶选择性酯交换法
• 1.3.2.3 脂肪酶选择性酯化法
• 1.4 立题背景与研究内容
• 1.4.1 立题背景与意义
• 1.4.2 主要研究内容
• 第二章 HPLC 法直接测定 EPA、DHA 游离脂肪酸的方法研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料及方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 流动相组成对鱼油水解样中组分保留时间的影响
• 2.3.2 pH 值对EPA/DHA 在色谱柱中保留行为的影响
• 2.3.3 温度对分离 EPA/DHA 的影响
• 2.3.4 优化条件下的容量因子和分离度
• 2.3.5 EPA/DHA 的线性关系、检测限和定量限
• 2.3.6 方法精密度实验
• 2.3.7 加样回收率实验
• 2.3.8 两种方法测定样品中 EPA、DHA 含量的比较
• 2.4 本章小结
• 第三章 鱼油水解工艺的优化及水解液中EPA/DHA 的富集
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料及方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 鱼油原料常规指标的测定
• 3.2.2.2 鱼油不饱和脂肪酸组成的分析
• 3.2.2.3 EPA/DHA 的定量分析
• 3.2.2.4 鱼油的化学水解
• 3.2.2.5 鱼油的酶法水解
• 3.2.3 产率的计算
• 3.2.4 C18 层析柱分离纯化样品
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 鱼油原料各项指标的测定
• 3.3.2 两种水解方式的结果及比较
• 3.3.3 化学水解工艺条件的优化
• 3.3.3.1 碱溶剂种类对水解效果的影响
• 3.3.3.2 皂化时间对水解效果的影响
• 3.3.3.3 皂化温度对水解效果的影响
• 3.3.3.4 乙醇/水的比例对水解效果的影响
• 3.3.4 EPA、DHA 的富集
• 3.3.4.1 质谱分析
• 3.3.4.2 层析分离
• 3.4 本章小结
• 第四章 EPA/DHA 甘油酯的间歇合成生产工艺研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料及方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 有机溶剂脱水
• 4.2.2.2 脂肪酶催化合成ω-3PUFA 甘油酯的间歇生产工艺
• 4.2.2.3 ω-3PUFA 甘油酯定量分析
• 4.2.2.4 酯化度的计算方法
• 4.2.2.5 MS 验证各目标峰
• H-NMR、¹³C-NMR 分析验证 EPA 和 DHA 甘油三酯'>4.2.2.6^H-NMR、¹³C-NMR 分析验证 EPA 和 DHA 甘油三酯
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 有机相中 EPA 甘油酯的合成
• 4.3.2 反应溶剂的选择
• 4.3.3 分子筛的添加时间对 EPA 甘油酯合成的影响
• 4.3.4 甘油/EPA 摩尔比对EPA 甘油酯合成的影响
• 4.3.5 反应温度对 EPA 甘油酯合成的影响
• 4.3.6 酶添加量对 EPA 甘油酯合成的影响
• 4.3.7 DHA 甘油酯合成
• 4.4 本章小结
• 第五章 EPA/DHA 甘油酯的连续化合成生产工艺初探
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料及方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 有机溶剂脱水
• 5.2.2.2 ω-3PUFA 甘油酯的连续合成装置
• 5.2.2.3 ω-3PUFA 甘油酯定量分析
• 5.2.2.4 酯化度的计算方法
• 5.3 结果和讨论
• 5.3.1 反应溶剂的选择
• 5.3.2 分子筛加入对酯化反应的影响
• 5.3.3 反应装置的选择
• 5.3.4 EPA/甘油摩尔比对 EPA 甘油酯合成的影响
• 5.3.5 不同的反应温度对 EPA 甘油酯合成的影响
• 5.3.6 不同的滞留时间对 EPA 甘油酯合成的影响
• 5.3.7 DHA 甘油酯的连续化合成
• 5.4 本章小结
• 主要结论
• 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文