论文摘要
第一部分自发性糖尿病小鼠耳蜗组织形态学与细胞凋亡改变目的:采用自发性糖尿病小鼠模型,探讨早期糖尿病耳蜗病理形态学及细胞凋亡改变。方法:NOD雌鼠随机分为糖尿病4w组（D4组）、糖尿病12w组（D12组）和正常对照组（NC组）。采用耳蜗半薄切片甲苯胺蓝染色观察组织形态改变,扫描电镜观察毛细胞缺失情况,耳蜗半薄切片TUNEL法染色和耳蜗毛细胞核荧光染色计数观察耳蜗细胞凋亡情况。结果:1.耳蜗半薄切片甲苯胺蓝染色:NC组耳蜗Cortis器、螺旋神经节、血管纹和螺旋韧带形态正常;D4组Cortis器皱缩,内、外毛细胞核偶有缺失,但细胞结构尚完整,螺旋神经节细胞细胞核肿胀,数目减少,神经纤维排列紊乱,血管纹水肿样变,有微血栓形成;D12组Cortis器塌陷,内、外毛细胞及支持细胞有缺失,螺旋神经节细胞数目进一步减少,神经纤维束松散,血管纹萎缩,微动脉瘤形成。2.耳蜗扫描电镜观察:NC组耳蜗内、外毛细胞纤毛形态正常;D4组底回外毛细胞纤毛倒伏、断裂,内毛细胞散在性缺失,顶回内、外毛细胞纤毛无明显缺失;D12组内、外毛细胞纤毛散在性缺失明显。3.耳蜗组织凋亡活性:NC组血管纹、螺旋神经节有少量凋亡细胞,螺旋韧带和Cortis器未见凋亡细胞;D4组Cortis器、螺旋神经节、血管纹、螺旋韧带和支持细胞均可见到凋亡细胞;D12组比D4组凋亡细胞明显增多,差异有统计学意义（P＜0.05）;糖尿病组凋亡细胞数底回比顶回多,差异有统计学意义（P＜0.05）。4.耳蜗毛细胞核碘化丙啶-吖啶橙荧光染色计数观察:NC组未见明显凋亡毛细胞;D4组顶回和底回的内、外毛细胞中均可见显橙黄色荧光的凋亡细胞,毛细胞顶回凋亡率为22.33±1.72%,底回凋亡率为26.53±1.96%;D12组毛细胞顶回凋亡率为58.32±1.67%,底回凋亡率为84.32±1.77%,与D4组相比,凋亡细胞显著增多（P＜0.05）,并有散在性毛细胞缺失。结论:1.NOD小鼠早期即有明显Cortis器、螺旋神经节细胞、血管纹及螺旋韧带等结构病理形态改变。2.NOD小鼠耳蜗组织损伤表现出从顶回到底回逐渐加重,内毛细胞较外毛细胞损伤重,随着糖尿病病程延长损伤加重的病理形态特点。3.凋亡是糖尿病耳蜗细胞损伤或死亡的一种重要方式。第二部分Bax、Bcl-2、Caspase-3在自发性糖尿病小鼠耳蜗损伤中的作用目的:了解Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白在自发性糖尿病小鼠耳蜗损伤过程中的空间分布特点和表达时间规律,探讨Bax、Bcl-2、Caspase-3在自发性糖尿病小鼠耳蜗损伤中的分子作用机制,为糖尿病耳蜗损伤的药物防治提供理论依据。方法:采用石蜡包埋的免疫组织化学技术,对各组近中轴位耳蜗切片行Bax、Bcl-2、Caspase-3免疫组织化学染色,光学显微镜下观察耳蜗组织中的表达情况。提取各组耳蜗组织总蛋白,采用Western blot技术检测各组Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平。结果:1.免疫组织化学检测bax、bcl-2、caspase-3表达:NC组耳蜗各回Cortis器、螺旋神经节、血管纹和螺旋韧带的细胞质和细胞核内无bax及caspase-3阳性细胞,但bcl-2在细胞质呈阳性表达;D4组耳蜗各回以上结构中bax及caspase-3在细胞质内呈阳性表达,bcl-2在细胞核和细胞质内呈阳性表达;D12组上述部位中bax及caspase-3在细胞核和细胞质内呈阳性表达,以螺旋神经节和螺旋韧带表达尤为明显,而bcl-2在上述部位细胞质内呈阳性表达;与NC组相比,D4组和D12组bax、caspase-3及bcl-2表达明显增高,差异有统计学意义（P＜0.05）;与D12组相比,D4组bax及caspase-3表达低于D12组,但bcl-2表达明显增高,差异有统计学意义（P＜0.05）;D4组和D12组顶回和底回相比,底回bax、caspase-3及bcl-2表达增高,差异有统计学意义（P＜0.05）。2.western blot法检测bax、bcl-2、caspase-3蛋白表达:在分子量为24kDa,28kDa及35kDa处依次可见bax、bcl-2及caspase-3条带。NC组bax/β-actinOD比值为30.27%,bcl-2/β-actinOD比值为111.67%,caspase-3/β-actinOD比值为6.79%;D4组bax/β-actinOD比值为110.54%,bcl-2/β-actinOD比值为158.37%,caspase-3/β-actinOD比值为64.42%;D12组bax/β-actinOD比值为209.87%,bcl-2/β-actinOD比值为50.89%,caspase-3/β-actinOD比值为80.18%。与NC组相比较,D4组耳蜗组织中的bax、caspase-3及bcl-2含量显著增多（P＜0.05）,D12组耳蜗组织中的bax、caspase-3含量显著增多（P＜0.05）,但bcl-2含量显著下降（P＜0.05）。与D12组相比较,D4组耳蜗组织中的bax及caspase-3含量明显少于D12组（P＜0.05）,但bcl-2含量明显多于D12组（P＜0.05）。bcl-2/bax比值在NC组为3.63,D4组为1.43,D12组为0.24。结论:1.NOD小鼠耳蜗组织中细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达增高,提示细胞凋亡参与了自发性糖尿病小鼠耳蜗损伤,可能机制与细胞凋亡的线粒体途径有关。2.随着糖尿病病程的延长,抗凋亡因子Bcl-2下调,促凋亡因子Bax和Caspase-3表达上调,提示细胞凋亡随糖尿病病程加重。第三部分依达拉奉对自发性糖尿病小鼠耳蜗的保护作用目的:探讨依达拉奉听泡灌注对糖尿病早期耳蜗的保护作用及分子作用机制,为依达拉奉内耳局部用药治疗糖尿病耳蜗损伤提供理论依据。方法:NOD雌鼠随机分为药物干预组（MT组）、糖尿病模型组（DM组）和正常对照组（NC组）。在糖尿病4w行依达拉奉听泡灌注,隔天灌注1次,用药共4次,第7d处死小鼠。DM组为同批糖尿病发病4w的假手术NOD雌鼠。耳蜗半薄切片次甲基蓝-碱性复红染色观察组织形态改变。TUNEL法染色和耳蜗毛细胞核荧光染色计数观察细胞凋亡情况。对各组近中轴耳蜗石蜡切片行Bcl-2、Bax和caspase-3免疫组织化学染色,观察依达拉奉听泡灌注对Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达的影响。结果:1.耳蜗半薄切片次甲基蓝-碱性复红染色:MT组耳蜗底回和顶回Cortis器形态结构完整,内、外毛细胞未见明显缺失,螺旋神经节细胞排列紧密,形态均一,神经纤维排列规则,呈束状,血管纹和螺旋韧带形态正常,结构清楚,显色均匀。2.耳蜗组织凋亡活性:MT组耳蜗Cortis器、螺旋神经节、血管纹和螺旋韧带有散在凋亡细胞,与DM组比较表达明显降低（P＜0.05）,而与NC组间差异无统计学意义（P＜0.05）。3.耳蜗毛细胞核PI-AO荧光染色计数观察:MT组耳蜗毛细胞缺失不明显,细胞核呈圆型,大小一致,排列有序,染色均匀,显绿色荧光,未见明显凋亡细胞,毛细胞缺失率为0.05%,毛细胞凋亡率为1.31%;与DM组比较,凋亡细胞明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）;与NC组比较,细胞凋亡无明显增加,差异无统计学意义（P＞0.05）。4.耳蜗石蜡切片bax、bcl-2、caspase-3免疫组织化学检测:MT组Cortis器、螺旋神经节、血管纹和螺旋韧带bax在细胞质中呈阳性表达,caspase-3呈阴性表达,bcl-2在细胞核及细胞质中呈阳性表达;与NC组比较,MT组bax及caspase-3表达无明显增高,差异无统计学意义（P＞0.05）,而bcl-2表达明显增高（P＜0.05）;与DM组比较,MT组bax及caspase-3表达明显降低（P＜0.05）,而bcl-2表达明显增高,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.依达拉奉听泡灌注能减轻NOD小鼠耳蜗Cortis器、螺旋神经、血管纹和螺旋韧带细胞凋亡。2.依达拉奉听泡灌注可使NOD小鼠耳蜗组织中抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调,促凋亡蛋白Bax和caspase-3表达下调。