大豆抗氧化肽的制备与表征

论文摘要

本研究以低温脱脂豆粕为原料,采用优化后的Nagano法分离制备7S和11S大豆球蛋白。选取Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶水解分离得到的7S和11S大豆球蛋白制备抗氧化活性的肽。通过大豆球蛋白酶解液体外抗氧化活性的测定筛选出水解液抗氧化性较高的蛋白酶类,利用正交试验优化了其水解大豆球蛋白的反应条件。在最适水解条件下制备抗氧化活性肽水解物,进行水解产物中抗氧化活性肽的分离,选取抗氧化活性较强的肽组分,利用高效凝胶色谱法分析其分子量分布,并对其氨基酸组成进行分析。利用优化后的Nagano法分离制备7S和11S大豆球蛋白通过SDS-PAGE电泳分析可知,分离得到7S和11S大豆球蛋白的相对纯度分别达到83.68%和87.59%。选取五种蛋白酶分别在各自最适水解条件下水解分离得到的7S和11S大豆球蛋白,水解时间为1h、2h、3h、4h和5h,以保护因子、对DPPH自由基清除率和水解度为指标综合考虑,从五种蛋白酶中筛选出水解大豆球蛋白抗氧化活性较高的酶类为Alcalase碱性蛋白酶,其优化的水解大豆球蛋白的条件为:温度55℃,pH值8.0,加酶量为5%（[E]/[S]）,底物浓度为4%。随着水解时间的延长,Alcalase碱性蛋白酶对蛋白的水解度在增加,但是水解产物的抗氧化活性是先增大后减小,水解时间为4h时的水解产物体外抗氧化活性最高,7S和11S大豆球蛋白酶解物保护因子分别为1.48和1.46,DPPH自由基清除率分别为60.85%和58.15%。用超滤和凝胶层析对大豆球蛋白水解物中具有抗氧化活性的肽进行分离。水解液用超滤膜分级后,获得了分子量大于30kDa、10kDa-30kDa、5kDa-10kDa和小于5kDa的组分。11S和7S球蛋白Alcalase碱性蛋白酶水解物分子质量小于5kDa组分的多肽分子质量主要集中在1000Da以下,分别占92.92%和87.53%,含量分别约为82.6%和89.1%。通过抗氧化活性和DPPH自由基清除率的测定比较分析,得到小于5kDa组分抗氧化活性最好。经Sephadex G-25凝胶层析对7S和11S大豆球蛋白酶解物超滤后得到的该组分进行进一步分离,得到A、B、C、D四个组分样品中,组分A的抗氧化活性最好,四个组分的抗氧化活性次序依次为A>C>B>D。分别以牛血清白蛋白、VB12和还原型谷胱甘肽为标准物质制作标准曲线,根据凝胶层析标准曲线得到公式Y=-0.0135X+5.1889。由此所得公式大致推算峰A的分子量大概为1068.81 Da。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 大豆及加工利用现状
• 1.1.2 豆粕加工及其利用
• 1.1.3 大豆蛋白的组成与结构
• 1.1.4 大豆蛋白质资源开发及利用现状
• 1.1.5 大豆蛋白水解及水解物功能性质
• 1.1.5.1 生物活性肽的的概述
• 1.1.5.2 大豆蛋白酶法水解
• 1.1.5.3 大豆肽的组成及其功能性
• 1.1.6 自由基的产生与危害
• 1.1.7 机体内自由基清除机制及抗氧化原理
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 大豆抗氧化肽的国内研究进展
• 1.2.2 大豆抗氧化肽的国外研究进展
• 1.2.3 大豆抗氧化多肽抗氧化机理的研究进展
• 1.3 本课题的研究内容
• 1.3.1 7S 和11S 大豆球蛋白的制备
• 1.3.2 蛋白酶的筛选
• 1.3.3 Alcalase 碱性蛋白酶水解条件优化
• 1.3.4 抗氧化肽的分离
• 1.3.5 分子量分布及氨基酸的测定
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 7S 和11S 大豆球蛋白的制备
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料与仪器设备
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 原料基本成分的测定
• 2.2.2.2 7S 和11S 大豆球蛋白的分离方法
• 2.2.2.3 7S 和11S 大豆球蛋白纯度的测定及分析
• 2.3 试验结果与讨论
• 2.3.1 原料基本成分分析
• 2.3.2 SDS–PAGE 电泳图谱及分析结果
• 2.4 小结
• 第三章 7S 和11S 大豆球蛋白的酶水解条件研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 实验材料与仪器设备
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 蛋白酶活力的测定方法（福林-酚试剂法）
• 3.2.2.2 蛋白酶的初步筛选和大豆球蛋白酶水解
• 3.2.2.3 7S 和11S 大豆球蛋白酶水解方法
• 3.2.2.4 水解度的测定方法
• 3.2.2.5 酶解物对DPPH 自由基的清除作用
• 3.2.2.6 酶解物抗氧化活性的测定
• 3.2.2.7 正交试验表设计
• 3.3 试验结果与分析
• 3.3.1 蛋白酶酶活力测定
• 3.3.1.1 酪氨酸标准曲线的绘制
• 3.3.2.2 蛋白酶活力的测定结果
• 3.3.2 蛋白酶的筛选和酶水解大豆球蛋白最适时间的确定
• 3.3.2.1 11S 和7S 大豆球蛋白水解度的测定结果
• 3.3.2.2 7S 和11S 大豆球蛋白酶解物抗氧化活性的测定
• 3.3.2.3 11S 和7S 大豆球蛋白酶水解物DPPH 自由基清除率测定结果
• 3.3.3 Alcalase 碱性蛋白酶水解大豆11S 和7S 球蛋白正交试验结果
• 3.3.3.1 大豆11S 和7S 球蛋白酶水解物对保护因子的正交试验
• 3.3.3.2 大豆11S 和7S 球蛋白酶水解物DPPH 自由基清除率正交试验
• 3.4 小结
• 第四章 大豆球蛋白水解物抗氧化活性肽分离及表征
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料与仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 大豆组分蛋白酶解液的制备方法
• 4.2.2.2 大豆球蛋白酶解液的超滤
• 4.2.2.3 大豆球蛋白超滤后分子量小于5kDa 组分的氨基酸分析
• 4.2.2.4 高效液相凝胶色谱法
• 4.2.2.5 凝胶层析分离
• 4.2.2.6 大豆肽分子量分布的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 超滤结果分析
• 4.3.2 氨基酸组成比较分析
• 4.3.3 多肽分子量分布分析
• 4.3.3.1 大豆多肽超滤后小于5kDa 组分的紫外扫描分析
• 4.3.3.2 大豆多肽超滤后分子量小于5kDa 组分的凝胶色谱分析
• 4.3.4 Sephadex G-25 凝胶层析结果
• 4.4 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历