论文摘要
增生性瘢痕（hypertrophic scar,HTS）是由于皮肤受热力或者其它因素损伤后,胶原纤维和其它细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积所致。ECM的过度沉积导致纤维化的形成,常常引起患者美观和功能上的严重损害。增生性瘢痕的发病机制已成为烧伤修复领域研究的重点。我们在前期研究中选用含4096个人类基因的表达谱芯片对5例增生性瘢痕患者及自身正常皮肤进行差异表达基因的筛选,发现P311基因高表达于新生的增生性瘢痕内;随后利用酵母双杂交技术筛选出β4-整合素结合蛋白（Integrin beta 4 binding protein,ITGB4BP）为其相互作用蛋白。不过P311对于Ⅰ型胶原蛋白和MMP-9等与ECM合成与代谢相关蛋白的影响不具有明显的统计学意义,因此我们转而对ITGB4BP在成纤维细胞中的表达与功能进行了初步探讨。Wnt信号通路参与调控细胞的分化、癌变、凋亡等生理病变过程。近几年研究表明,Wnt信号通路的异常活化与皮肤纤维化的发生与进展关系密切。本课题组前期研究表明,ITGB4BP可以调控皮肤成纤维细胞的胞外基质生成,为深入研究其机制,本研究探讨了ITGB4BP对Wnt/β-catenin信号通路的影响。我们设计并进行了如下实验研究: 1.真核表达载体质粒pCMV-ITGB4BP的构建通过PCR方法扩增人ITGB4BP基因,利用XhoⅠ和Bam HⅠ酶切位点将其克隆至pCMV-3Tag-3B质粒中,转化大肠杆菌DH5α后,经酶切与测序鉴定后,真核表达载体质粒pCMV-ITGB4BP构建成功,为下一步继续研究ITGB4BP对Wnt/β-catenin信号通路活性的影响提供了基础。2. ITGB4BP对Wnt/β-catenin信号通路活性影响的实验研究将对照组空载体pCMV-3B质粒和实验组pCMV-ITGB4BP质粒分别转染至HEK293细胞中,用Western blot和激光共聚焦技术检测细胞中β-catenin含量的变化,用含TCF/LEF启动子的荧光素酶TOPFlash质粒和内参pRL-TK质粒共转染对照组和实验组的HEK293细胞,用荧光素酶活性分析法检测ITGB4BP转染后HEK293细胞TCF/LEF活性的变化。设不转染质粒组为正常组,对照组和实验组均分别设未加LiCl组和加LiCl组。结果表明:ITGB4BP可以显著降低细胞内β-catenin的水平（P < 0.05）、减弱β-catenin显示的荧光强度以及显著降低TCF/LEF转录活性（P < 0.05）,3个结果一致表明ITGB4BP可抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性。综上所述,本课题首先构建了真核表达载体质粒pCMV-ITGB4BP,再以具有较高转染效率的人源性细胞HEK293为细胞模型,发现ITGB4BP可以下调Wnt/β-catenin信号通路的活性,进而为下一步研究ITGB4BP抑制皮肤纤维化可能的作用机制奠定了基础。