东北红豆杉与美丽镰刀菌的固定化法共生培养

论文摘要

紫杉醇是一种二萜类衍生化合物,最早从红豆杉属植物中分离出来。由于其抗癌机制独特,对多种恶性肿瘤疗效突出,一直备受人们的关注。近年来国内外利用红豆杉细胞培养法和植物内共生真菌发酵法产生紫杉醇成为研究热点,但实现工业化生产的关键问题难以突破,产量性状不能满足生产要求。内共生真菌长期与宿主协同进化并形成了互惠互利的共生关系,相关研究显示内共生菌能够参与植物活性成分的合成或者转化;红豆杉内共生真菌产生的诱导物能限制植物细胞生长,促进紫杉醇合成与分泌;植物产生的诱导物也可促进内共生真菌的紫杉醇合成与分泌。因此,模拟内共生真菌与宿主植物的共生环境可能有助于研究两者的关系、次生代谢产物的合成机制等。但内共生真菌与红豆杉植物细胞的离体培养无论是从环境条件（pH、溶氧、剪切力、培养基成分等）,还是生长代谢（生理状态、生长周期、代谢产物、代谢途径等）都存在巨大差异。本论文采用固定化培养法模拟东北红豆杉（Taxus cuspidate）和美丽镰刀菌（Fusarium mairei）的共生环境,在保持两类细胞生命活力的条件下对其相互作用进行初步研究,以期提高各自紫杉醇产量。主要研究方法和结果如下:1.固定化细胞选择和培养的探索:探索了F. mairei的三种海藻酸钙固定化法和两种聚乙烯醇固定化法;T. cuspidate细胞的海藻酸钙固定化法,通过比较T. cuspidate与F. mairei的固定化培养状况,选择一种细胞和一种方法进行固定化培养。并详细地研究了固定化条件包括培养基选择、海藻酸钠溶液浓度、CaCl2溶液浓度、细胞包埋密度、凝胶珠直径等多种因素对固定化细胞的活力与紫杉醇产量的影响。结果显示,F. mairei的固定化操作不具有实用性。T. cuspidate细胞采用最温和的海藻酸钙固定化法,海藻酸钠浓度在20 g/L时,T. cuspidate细胞包埋量在0.15～0.2 g/mL之间时,凝胶直径在3～4 mm时,细胞细胞生长较稳定,耗糖较快,酚类产量较低,且包埋的细胞没有渗漏。2.共生培养体系的优化:详细地研究了T. cuspidate与F. mairei的接种量、接种时间、培养时间等多种因素对共生培养体系的影响。并进行对照实验,排除植物细胞内紫杉醇残留、死细胞分泌物或者渗漏的细胞碎片、固定化实验材料等因素对实验结果的干扰。通过正交实验优化共培养体系的最佳实验条件为:海藻酸钠浓度2%（M/V）,T. cuspidate细胞包埋量0.15 g/mL,CaCl2浓度4%（M/V）,凝胶直径为3～3.5 mm,钙化0.5h,以40 mL接种量接入装液量均为70 mL/250 mL的共生培养基。25℃、黑暗、160 r/min震荡培养。植物细胞培养第9天接入10%（V/V）对数期的F. mairei培养物,继续培养10天后收获。结果表明,F. mairei对T. cuspidate细胞的生长有强烈抑制作用,能诱导紫杉醇等次生代谢物向胞外分泌;T. cuspidate细胞的分泌物对F. mairei的紫杉醇产量也有显著影响。3.选择合适的培养基与发酵条件,以期提高紫杉醇的产量。详细地研究了培养基成分（改良MS培养基主要营养元素、促细胞活力添加剂、促紫杉醇产量添加剂等、促产物释放添加剂等）对共培养体系中的传质效果、F. mairei的紫杉醇生产和菌体增殖、固定化T. cuspidate的细胞活力等的影响,以及摇瓶装液量、补加碳源对终产量的影响。结果显示,培养基中CA含量的升高有利于F. mairei菌体的增殖,鉴于紫杉醇积累和细胞生长之间的矛盾,二者最佳平衡点即MS培养基原有添加量;细胞生长素2,4-D、NAA和细胞分裂素6-BA对F. mairei的紫杉醇生产和菌体增殖几乎没有影响,细胞分裂素KT的浓度升高时对F. mairei的紫杉醇产量有抑制作用;在F. mairei培养第6天补加30 g/L蔗糖可以促进紫杉醇产量提高和代谢物释放。装液量的差异导致的溶氧差异也能显著影响紫杉醇产量。本实验改良MS培养基,提高原有矿物质元素KH2PO4、CaCl2、（NH4）2SO4、FeSO4- Na2·EDTA浓度均不利于F. mairei的紫杉醇生产;提高CaCl2、（NH4）2SO4、FeSO4-Na2·EDTA浓度对F. mairei的菌体增殖还有抑制作用,可能是pH偏酸性引起菌体代谢合成途径不同。不同浓度的H3BO3对F. mairei的紫杉醇生产和菌体增殖几乎没有影响,推测F. mairei采用PVA-H3BO3固定化法培养时细胞生长受到抑制的主要影响因素是PVA、固定化操作环节或是酸性pH。化学释放剂对F. mairei的紫杉醇生产和菌体增殖、对T. cuspidate细胞固定化培养中紫杉醇释放率的影响都很稳定,固定化培养T. cuspidate细胞的紫杉醇等代谢物还是F. mairei培养物促释放效果显著。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 紫杉醇概述
• 1.2 紫杉醇生产现状
• 1.2.1 化学合成及半合成
• 1.2.2 植物细胞离体培养法
• 1.2.3 微生物转化法
• 1.2.4 微生物发酵方法
• 1.2.5 内共生真菌与其宿主植物的共生关系
• 1.3 细胞固定化技术在两种细胞共同培养中的应用
• 1.3.1 植物细胞固定化技术的特点与应用
• 1.3.2 微生物细胞固定化技术的特点与应用
• 1.4 本论文的主要研究内容
• 1.4.1 固定化法共生培养需解决的问题
• 1.4.2 本论文的主要研究内容
• 第二章 细胞固定化培养的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌种和细胞株
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 药品与试剂
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 培养方法
• 2.2.6 紫杉醇提取方法
• 2.2.7 紫杉醇含量测定
• 2.2.8 胞外总酚含量的测定
• 2.2.9 pH 的测定
• 2.2.10 胶球体积的测定
• 2.2.11 可溶性蛋白质含量的测定
• 2.2.12 总糖的测定
• 2.2.13 生物量（DCW）的测定方法及生长曲线绘制
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 各标准曲线的绘制
• 2.3.2 F.mairei 在改良MS 培养基中的生长状况
• 2.3.3 利用海藻酸钙包埋法固定化F. mairei 细胞的方法
• 2.3.4 利用PVA－H3803 包埋法固定化F. mairei 细胞的方法
• 2.3.5 固定化T. cuspidate 细胞在改良MS 培养基中的生长状况
• 2.3.6 利用海藻酸钙包埋法固定化T. cuspidate 细胞的影响因素
• 2.4 本章小结
• 第三章 共生培养条件优化的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌种和细胞株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 实验方法
• 3.2.6 干扰因素排除实验设计
• 3.2.7 正交实验优化共培养条件
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 F. mairei 接种量对共培养的影响
• 3.3.2 固定化T. cuspidate 接种量对共培养物紫杉醇产量的影响
• 3.3.3 共培养接种时间的选择
• 3.3.4 正交试验优化共培养条件
• 3.3.5 干扰因素排除实验
• 3.4 本章小结
• 第四章 共生培养基与发酵条件改良的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌种和细胞株
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 主要仪器
• 4.2.5 紫杉醇的提取及测定方法
• 4.2.6 其他分析方法
• 4.2.7 共培养基础实验
• 4.2.8 培养基配方的优化
• 4.2.9 发酵条件的优化
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 共生培养基成分的优化
• 4.3.2 共培养发酵条件的优化
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文