马美红陈春妍（惠东县人民医院检验科广东惠东516300）
【摘要】目的建立手工丽春红S法检测尿蛋白的性能验证方案和实验方法。方法参考美国临床和实验室标准化协会（CLSI）系列文件和相关文献[3-5]，结合工作实际，设计验证方案。对手工丽春红S法检测尿蛋白的精密度、准确度、分析灵敏度、分析测量范围、临床可报告范围等性能进行验证和评价，并将实验结果与美国强生Vitros350干式生化分析仪所检测尿蛋白的结果进行比较。结果尿蛋白含量在0.2g/L、4.0g/L时，手工丽春红S法测得日间不精密度分别为6.4%和1.05%；10个标准浓度检测结果与靶值的相对偏差均小于6.4%；检测低限为0.2g/L；生物检测线在0.2～4.0g/L，功能灵敏度为0.5g/L，分析测量范围为0.2～4.0g/L。厂商提供的美国强生Vitros350干式生化分析仪日间不精密度CV<2.4%；检测低限为0.012g/L；分析测量范围0.017～0.024g/L。结论建立了临床手工丽春红S法检测尿蛋白的分析性能验证方案和实验方法。本研究对规范医学实验室建设和实验室认可，提高实验室手工法检测质量有重要意义。
【关键词】性能验证尿总蛋白丽春红比色法干化学法
【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）23-0035-03
国际标准化组织（ISO）于2003年颁布了《医学实验室质量和能力的专用要求》（ISO15189）[1]作为医学实验室认可的标准，该标准要求申请认可的实验室应对设备、检测系统或方法的主要分析性能进行验证，证实其能够达到所要求的性能标准。我国2006年颁布的《医疗机构临床实验室管理办法》要求，对未开展室间质评的检验项目，临床实验室必须对检测系统的分析性能进行评价，才可将分析系统用于常规工作。国内近几年对各种全自动分析检测仪器的性能验证的报道不在少数，但对临床手工法的检测性能验证却很少。如何合理选择、系统设计定量检测项目方法学性能验证方案和实验方法的报道，更是少之又少。故在此我们参考美国临床实验室标准协会(CLSI)系列文件和相关文献，结合具体实际，探讨临床手工丽春红S法测定尿蛋白的方法学性能验证方案和实验方法，并将结果与国际公认的质量指标进行比较。
一、材料与方法
1.仪器和试剂
722S型分光光度计（上海科技仪器公司）及丽春红S染料、蛋白沉淀剂三氯乙酸以及0.2mol/L氢氧化钠溶液，具体方法参考全国临床操作规程（第三版）。
二、验证方法和实验方法
1.精密度验证实验：严格按照分光光度计标准操作规程对仪器进行维护保养、校准和质量控制，选择低值（0.2g/L）和高值（4.0g/L）2个浓度的标准品，按标本检验程序进行吸光度测定。每天1次，连续20次，计算x-±s和变异系数CV。
2.准确度验证实验：（1）用浓度2.0g/L的校准品校准检测系统测定其吸光度，再对其它浓度的校准品进行检测，换算成浓度后将其检测结果与各自的标示值（靶值）进行比对，并计算检测值与靶值的相对偏倚（%），与可接受限进行比对。
3.分析灵敏度验证实验：分析灵敏度或检测限系指检测系统可检测的最低分析物浓度。包括检测低限（lowerlimitofdetection,LLD）、生物检测限(biologiclimitofdetection,BLD)、和功能灵敏度（functionalsensitivity,FS）。按参考文献[5-6]介绍的方法进行验证。（1）样品制备：对原70g/L的丽春红标准品分别稀释成1/5g/L、1/4g/L、1/3g/L、1/2g/L、1.0g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L的浓度，作为分析灵敏度的实验样品；（2）样品测定：空白样品批内重复测定10次，其他系列样品天间重复测定10次，记录每次检测的发光强度值（RLUs）和浓度值（g/m）；（3）LLD的确定：LLD为样品单次检测，可以达到的非空白检测响应量对应的分析物的量。按99.7%的可信限，最低浓度样品RLUsx-±3s所对应的尿蛋白含量即为LLD；（4）BLD的确定：某样品单次检测可能具有的最小响应量刚大于空白检测低限响应量，该样品内含有的分析物浓度为BLD。以LLD的发光强度值为界，在系列低浓度结果中，某浓度下的RLUsx-±3s的RLUs，刚好大于LLD的吸光度值，此样品光强度均值对应的尿蛋白含量为BLD；（5）FS的确定：以天间重复CV为20%时对应检测限样品具有的平均浓度为检测系统可定量报告分析物的FS。系列浓度样品天间重复测定RLUs均值减去最低浓度RLUs均值后，CV刚大于20%的样品对应的尿蛋白浓度为FS。
4.分析测量范围验证实验：分析测量范围（analyticalmeasurementrange,AMR）是指患者标本未经任何处理（稀释、浓缩或其他处理），由检测系统直接检测得到的可靠检测范围。将系列1/5g/L、1/4g/L、1/3g/L、1/2g/L、1.0g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L浓度标本在检测系统上重复测定4次，记录其吸光度结果。将实测值与预期值作比较，确定尿蛋白的AMR。
5.临床可报告范围验证实验[3]：临床可报告范围（Clinicalreportablerange,CRR)为患者标本经稀释、浓缩或其他处理后，向临床所能报告的结果范围。先进行稀释回收实验，确定标本稀释后可靠检测浓度的低限。
三、结果
1.精密度验证结果：2个不同浓度的标准品尿蛋白含量分别为0.2g/L和4.0g/L，按标本检验程序每天测定1次，连续20次，日间CV分别为6.4%和1.05%（表1）。浓度换算公式为：测试值/标准值。
表1精密度实验结果（g/L）
2.准确度验证结果：10个不同浓度的校准品的验证值与靶值的相对偏倚在之间0.41～6.41%(表2)。
表2校准品验证结果（g/L）
3.分析灵敏度验证结果：按99.7%的可信限，空白蒸馏水的RLUs为0，因此LLD为0.2g/L。0.2g/L标准品的RLUs减3s后为0.0012，>0，故BLD在0～0.2g/L之间。在0.5g/L浓度时，日间不精密度为29.1%。大于20%，故FS为0.5g/L。不同浓度标准品RLUs的计算结果见表3、表4。
表3系列标准浓度重复测定10次后的RLUs计算结果
注：RLUs下限=各浓度标本均值—3各浓度标本标准差。
表4不同浓度标准品RLUs测定结果
注：最下行为各浓度标本标准差s。
4.AMR验证结果：如下图（见表5）：采取平均斜率来确定系列样品应含有的待测物的预期值（X），所有样品重复测定的均值为实测值（Y），将所有结果点在X-Y坐标图上。计算回归方程：Y=bX+a。若相关系数r≥0.975，b在0.97～1.03范围内，a接近于0，则可判断线性范围。依下图判断，b=0.855，a=0.523，b接近于1，a接近于0，说明AMR上限为4.0g/L。结合本法的LLD为0.2g/L，故AMR为0.2～4.0g/L。
表5回归方程分析结果
5.CRR实验结果：见表6把原尿蛋白含量为70g/L的标准品稀释成1﹕350，1﹕280，1﹕210，1﹕140，1﹕70，1﹕35，1﹕28，1﹕23，1﹕20，1﹕17.5倍，计算稀释回收率=（实测值/预测值）100%。结果显示，当稀释倍数大于350倍时，除一份标本回收率超过可接受范围。因此，确定标本稀释后可靠检测浓度的低限约为0.2g/L。故本检测系统测定尿蛋白的CRR为0.2～4.0g/L。
表6稀释度测定结果(g/L)
四、讨论
检测系统的分析性能够满足临床要求是医学实验室认可和检验结果互认的根本保证[5-6]。根据美国《临床实验室改进法规修正案》（LIA′88）和ISO15189医学实验室认可的要求，在用于临床之前实验室必须对其主要分析性能进行验证，包括不精密度、不准确度、分析测量范围/临床可报告范围。美国强生Vitros350干式生化分析检测系统是经美国FDA认可的检测系统，生产厂商已经对其分析性能做了详细而全面的评估。本实验通过对临床手工丽春红S法检测尿蛋白的分析性能验证，并将其与干式生化分析检测尿蛋白进行比较。旨在为临床手工法的检测性能验证提供一套简便易行的验证方案和实验方法，也可供其他定量检验方法学性能验证时参考。
检测系统最主要的性能指标是精密度和准确度。本研实验以1个低值水平和1个高值水平的标准品为实验材料，每天做1次检测，连续20次，得到总不精密度，方法简便易行。实验结果显示，尿蛋白浓度在0.2g/L和4.0g/L时，总不精密度分别为6.4%和1.05%。干式生化分析的日间不精密度CV<2.4%。说明在尿蛋白的高值水平,丽春S法精密度更优于干化学法,低值水平也达到国际公认的质量要求(允许不精密度<6.0%)。准确度验证通常采用CLSIEP9-A2文件[7]，与参考系统或其他标准方法进行方法比对和偏倚评估。但检测尿蛋白的参考方法目前国际上尚未达成一致观点，且厂商也未提供强生Vitros350干式生化分析仪检测尿蛋白的相对偏倚。因此，本法无法与干化学法进行准确度的比较。可我们的实验结果显示：10个标准浓度检测结果与靶值的相对偏差在0.41%～6.41%范围,是达到国际公认的质量要求(允许偏差<11.9%)。
对检测系统的LLD和AMR验证结果显示：丽春红S法检测尿蛋白的LLD为0.2g/L小于干式生化分析仪所测定的0.012g/L，AMR为0.2～4.0g/L大于干化学的0.017～0.024g/L。清楚地表明丽春红S法检测低限不如干化学法，但丽春红S法比干化学法具有更宽的分析测量范围。另外，本实验还建立了丽春红S法测定尿蛋白的BLD和FS，其更能准确反映检测系统的分析灵敏度性能[8]。实验结果显示，该法测定尿蛋白的BLD在0.2～4.0g/L，FS为0.5g/L。CCR的结果表明，标本稀释后可靠检测浓度的低限约为0.2g/L，优于干化学法的0.7g/L。最大稀释度为1﹕350，而干式生化分析仪也无法自动稀释只能通过手工稀释。结合AMR上限最大稀释度，FS和临床决定水平，本实验测定尿蛋白地CRR为0.2～4.0g/L，当患者标本检验结果高于AMR时，必须稀释检测，但最大稀释度不宜超过350倍，标本稀释后的测定值也必须大于4.0g/L否则结果不可靠。
临床手工丽春红S法操作简便，影响因素少，且检测成本低，标本用量少和不粘附比色杯等优点被广泛使用。本实验通过对丽春红S法检测尿蛋白的主要分析性能进行验证，证明此法的分析性能可用于临床实验室的常规检测。同时也为临床用手工法检测性能验证提供了一套简便易行的验证方案和实验方法，对规范临床手工法的检测和提高实验室的检验质量有重要的意义。
参考文献
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[8]ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.C28-A2HowtodefineanddeterminereferenceintervalSintheclinicallaboratory：approvedguideline.2nded.Wayne.PA：CLSI,2000.