利用噬菌体展示技术鉴定vvIBDV抗原表位及多表位模拟蛋白表达

论文摘要

抗原表位,又称抗原决定簇,是抗原分子抗原性的基础。抗原表位是蛋白质抗原性的物质基础。用于正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病地诊断、设计无毒副作用地多表位疫苗以及免疫治疗试剂等具有积极的意义。因此目前在预防医学领域许多关于以表位为基础的,如表位疫苗和特异性诊断试剂等的研究也就成了热点。而噬菌体展示技术作为近年来新兴起的研究蛋白质抗原表位的有利工具,已经成功地鉴定出了多种病原微生物地抗原表位。这就为揭示一些病原体未知地抗原表位,从而进一步达到预防和控制疾病地发生提供了条件。传染性法氏囊病（Infectious bursal disease, IBD）是由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）引起的一种急性接触性传染病,是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官――法氏囊,导致免疫抑制。且对其他疫病的易感性增强,饲养成本增加的同时导致药物残留,危害人类健康,造成经济损失。近年来,IBDV分子生物学研究虽然己取得了较大进展,但在分子水平对鸡传染性法氏囊病病毒的免疫机理、致病机制、病毒分子结构与功能方面仍然有许多问题有待于进一步深入研究,而鉴定IBDV抗原表位有助于揭示病毒与机体相互作用的本质,从而了解IBDV的致病机制和免疫机理。本研究共分两个部分:一、四株IBDV-VP2单抗的抗原表位的鉴定和序列分析为研究IBDV的免疫机理和致病机理,利用4株IBDV VP2单克隆抗体1B5、5D1、2H11和I-4-4-3作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取15个单克隆蓝色噬菌斑,合计60个,通过间接ELISA检测,A405值均大于1.00,且均大于阴性对照A405值的2倍;竞争抑制ELISA分析,单克隆抗体和IBDV抗原均能竞争抑制筛选12肽与固相包被单克隆抗体的反应,抑制率大于40%,表明在该12肽内含有IBDV抗原表位。选取20个单克隆噬菌斑（5个单克隆噬菌斑×4株单克隆抗体）,经噬菌体pIII部分基因的核苷酸序列测定,确定了4个优势12肽为不同IBDV抗原表位,这4个12肽在一级结构上没有3个以上连续氨基酸与GenBank中IBDV VP2的氨基酸序列相同之处,推测可能是构象依赖性表位。二、IBDV多表位模拟肽串联基因的表达与免疫原性分析为研制抗原表位疫苗奠定基础,本研究利用4株传染性法氏囊病病毒（IBDV VP2）单克隆抗体（mAb）从噬菌体随机肽库中得到了4个含有不同IBDV VP2抗原表位的模拟肽序列。在此基础上,将4个抗原表位用GGGS四肽连接构建多表位基因4epis。将该基因合成、克隆后,构建原核表达质粒pET-4epis,在大肠杆菌中表达重组多表位蛋白r4EPIS,经扫描SDS-PAGE图分析,r4EPIS菌体占总蛋白的20%、分子量30kDa。用IBDV的单克隆抗体和多克隆抗体对r4EPIS进行免疫印迹对比分析,结果表明,r4EPIS具有IBDV特异性和免疫反应性。将r4EPIS经皮下注射免疫兔,第一次免疫7d后抗体效价为1:212,第二次免疫14d后抗体效价升高到1: 218,说明r4EPIS可诱导机体产生IBDV特异性抗体。用r4EPIS加免疫佐剂经肌肉注射免疫鸡,免疫2次后,血清抗体效价可达到1:214,用200个ELD50 IBDV超强毒株GX8/99攻击实验鸡,r4EPIS免疫组全部存话,而单用佐剂对照组的死亡率为80%（12/15）,证明r4EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答,预示构建的4epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 传染性法氏囊病的概述
• 1.1 病原学
• 1.1.1 IBDV 病毒学分类与结构特性
• 1.1.2 理化性质
• 1.2 IBDV 基因组的结构及其功能
• 1.3 IBD 疫苗及表位疫苗的研究进展
• 1.3.1 IBD 疫苗的研究
• 1.3.2 表位疫苗的研究
• 2 传染性法氏囊病毒抗原表位的研究现状
• 3 抗原表位的研究
• 3.1 抗原表位的研究方法
• 3.1.1 B 细胞抗原表位的研究方法
• 3.1.2 T 细胞抗原表位的研究方法
• 3.2 抗原表位的研究意义
• 4 噬菌体展示技术在抗原表位研究中的应用
• 4.1 噬菌体展示技术的原理
• 4.2 噬菌体展示技术的应用
• 4.3 噬菌体展示技术的优点
• 5 研究内容和方法
• 6 研究目的和意义
• 试验一 四株IBDV-VP2单抗的抗原表位的鉴定和序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 单克隆抗体
• 1.1.2 随机肽库、引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 肽库的生物淘选
• 1.2.2 噬菌体滴度测定
• 1.2.3 噬菌体扩增
• 1.2.4 测序模板的快速纯化
• 1.2.5 噬菌体短肽的间接ELISA 检测
• 1.2.6 单克隆抗体竞争抑制检测结合的特异性
• 1.2.7 IBDV 竞争抑制检测结合的特异性
• 1.2.8 噬菌体短肽测序分析
• 2 结果与分析
• 2.1 肽库生物淘选的产率
• 2.2 噬菌体短肽的ELISA 检测
• 2.3 单克隆抗体竞争抑制检测结合的特异性
• 2.4 IBDV 竞争抑制检测结合的特异性
• 2.5 测序及表位的序列分析
• 3 讨论
• 试验二 IBDV 多表位模拟肽串联基因的表达与免疫原性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 抗体
• 1.1.2 质粒和菌种
• 1.1.3 试剂和仪器
• 1.1.4 试验动物
• 1.2 方法
• 1.2.1 多表位基因的构建
• 1.2.2 引物的设计与合成
• 1.2.3 多表位基因的克隆与测序
• 1.2.4 构建表达质粒pET-4epis
• 1.2.5 Western-blot 分析
• 1.2.6 r4EPIS 对兔的免疫试验
• 1.2.7 r4EPIS 对鸡的免疫保护试验
• 2 结果与分析
• 2.1 多表位基因的克隆
• 2.2 pMD-4epis 的酶切鉴定结果
• 2.3 pET-4epis 酶切鉴定结果
• 2.4 4epis 基因扩增结果
• 2.5 pET-4epis 的表达
• 2.6 r4EPIS 的免疫反应性分析
• 2.7 r4EPIS 对兔的免疫试验
• 2.8 r4EPIS 对鸡的免疫保护试验
• 2.8.1 免疫
• 2.8.2 攻毒
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录