论文摘要
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）对细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的降解是肿瘤细胞侵袭、转移的关键步骤。其中Ⅳ型胶原酶（MMP-2和MMP-9）最为重要,在细胞外基质降解过程中起主导作用。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN/CD147）是新的细胞表面粘附分子,广泛表达于人的肿瘤细胞表面,诱导成纤维细胞产生MMPs,从而促进肿瘤的转移是目前肿瘤研究的热点。近年来儿童非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma,NHL）的疗效明显提高,但仍有部分患儿早期即有广泛结外侵润,短时期内复发或死亡。探索更多的诊断和治疗的突破点显得尤为重要。CD147作为肿瘤侵袭转移的一个重要指标已受到广泛关注,而CD147在恶性淋巴瘤细胞的表达及其与MMPs的关系报道甚少,尚未见其激动剂和抑制剂应用的报道。本研究旨在探讨CD147及MMPs在NHL侵袭转移中的作用及其调解机制,并将其抑制剂及siRNA沉默技术用于体外研究,为短肽类物质应用于NHL临床以及以CD147为靶点的基因治疗提供实验依据。第一部分:CD147和MMP-9在NHL中的表达及与预后的关系目的:探讨CD147和MMP-9在NHL中的表达,分析表达水平与临床分期、肿块大小、血清乳酸脱氢酶（LDH）水平及与预后的关系。方法:以临床肿瘤切除标本为研究对象,采用免疫组化、RT-PCR方法研究病理标本中CD147、MMP-9的表达及其与临床指标之间的关系,并作生存分析,探讨两者的相关性及其与NHL预后的关系。结果:1.免疫组化结果:73%病例（45/62）CD147表达阳性,其中（+）11例,（++）13例,（+++）21例,另阴性表达17例;81%病例（50/62）MMP-9表达阳性,其中（+）13例,（++）18例,（+++）19例,另阴性表达12例;CD147与MMP-9的表达有明显相关性。2.CD147的表达与临床骨髓侵润、肿块大小、LDH值以及临床分期有关,与患儿年龄、性别、免疫分型无关;MMP-9的表达与骨髓侵润和临床分期有关,与年龄、性别、免疫分型、肿块大小及LDH值无关。3.生存曲线分析:CD147（-）～（+）组和（++）～（+++）组5年存活率分别为78%（22/28）和45%（15/34）;MMP-9（-）～（+）组和（++）～（+++）组的5年存活率分别为84%（21/25）和43%（16/37）,组内比较均有显著差异。Cox多因素风险分析提示CD147和MMP-9都是影响预后的重要因素。4.RT-PCR结果显示:高危组（临床Ⅲ+Ⅳ期）CD147 mRNA表达为（0.897±0.043）,较低危组（临床Ⅰ+Ⅱ期）（0.281±0.051）增高,差异具有统计学意义（t=29.76,P＜0.01）。高危组中MMP-9mRNA表达（1.176±0.081）较低危组（0.363±0.073）增高,差异具有统计学意义（t=10.04,P＜0.01）。结论:CD147和MMP-9的表达与非霍奇金淋巴瘤的预后相关,高表达者预后不良。第二部分:CD147激动剂和抑制剂对Jurkat细胞增殖及侵袭力的影响目的:研究炎症因子亲环素A（cyclophilin A,CyPA）和CD147的拮抗肽9（antagonistic peptide 9,AP-9）对人T淋巴瘤Jurkat细胞系增殖、CD147的表达、上清MMP-9活性及侵袭转移能力的影响方法:1.以人T细胞淋巴瘤Jurkat细胞系为研究对象,四甲基偶氮唑蓝（MTT）方法检测CyPA组（50 ng/ml、100 ng╱ml、200 ng╱ml）、AP-9组（50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml）和CyPA+AP-9组（AP-9 200μg/ml分别加CyPA50 ng/ml、100ng/ml、200 ng/ml）作用6h、12h、24h后细胞增殖效应。2.免疫印迹方法检测CyPA组（50 ng/ml、200 ng/ml）、AP-9组（50μg/ml、200μg/ml）、CyPA+AP-9组（AP-9 200μg/ml分别加CyPA 50 ng/ml、200 ng/ml）处理12h、24h、36h后的Jurkat细胞的CD147蛋白表达水平。3.明胶酶谱分析CyPA组（50 ng/ml、200 ng╱ml）、AP-9组（50μg/ml、200μg/ml）、CyPA+AP-9组（AP-9 200μg╱ml分别加CyPA50 ng╱ml、200 ng╱ml）处理Jurkat细胞48h后上清MMP-9活性。4.Transwell小室侵袭试验检测CyPA组200 ng/ml;AP-9组200μg/ml;CyPA+AP-9组（CyPA 200 ng╱ml+AP-9 200μg╱ml）处理细胞48h后,计算迁移细胞数。结果:CyPA作用后,Jurkat细胞增殖活力增强,并且有时间和剂量依赖性,细胞CD147蛋白表达水平增加,上清MMP-9活性增强,迁移细胞数明显增多;相反AP-9作用后细胞增殖受抑制,CD147和MMP-9水平下降,迁移细胞数量减少;而CyPA+AP-9组细胞增殖、CD147蛋白、MMP-9水平以及迁移细胞数和对照组均无明显差异。结论:CyPA能促进Jurkat细胞增殖,诱导细胞CD147表达而刺激分泌MMP-9,促进肿瘤细胞的侵袭;而CD147的拮抗肽AP-9可抑制CD147的表达和MMP-9的分泌,从而抑制肿瘤细胞侵润,并且可以对抗CyPA的上述作用。提示CD147与Jurkat细胞的增殖与侵袭有关,CD147的拮抗肽有较好的应用前景。第三部分:RNA干扰沉默CD147基因对Jurkat细胞增殖及侵袭力的影响目的:1.构建CD147的RNA干扰真核表达载体。2.利用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）技术转染Jurkat细胞,探讨CD147基因沉默后对Jurkat细胞增殖、CD147的表达以及侵袭力的影响。方法:1.酶切法构建pGE-I-CD147shRNA重组质粒,电击转染至Jurkat细胞,G418筛选得到稳定表达重组质粒的细胞系2.RT-PCR检测转染细胞CD147mRNA的表达水平。3.流式细胞仪检测转染前后的细胞周期变化,了解转染对细胞增殖的影响4.基质粘附实验检测转染后细胞基质粘附能力的变化。结果:1.DNA测序证实CD147shRNA质粒载体构建成功,转染后筛选得到稳定重组质粒的细胞pGE-I-CD147shRNA1-Jurkat和阴性对照pGE-I-CD147shRNA2-Jurkat。2.RT-PCR检测,pGE-I-CD147shRNA1-Jurkat细胞CD147mRNA表达明显下降（CD147/β-actin灰度比0.35±0.03 vs 0.92±0.13）;流式细胞仪细胞周期分析pGE-I-CD147shRNA1-Jurkat细胞G0+G1期细胞较对照组比例明显增多。（89.85±7.85%vs 57.55±5.64%,P＜0.05）;基质粘附结果显示pGE-I-CD147shRNA1-Jurkat细胞粘附率较对照组比例明显增多（47.12±4.55%vs21.74±7.65,P＜0.05）。结论:通过siRNA技术沉默CD147基因表达可以抑制Jurkat细胞增殖,CD147表达水平下降,从而降低细胞的侵袭力,不同的RNA干扰片段能产生不同的干扰效应。进一步证实了CD147在NHL的作用,并为以CD147为靶点的基因治疗提供实验依据。全文总结:1.CD147和MMP-9的表达与NHL的预后相关,高表达者预后不良,为临床NHL预后判断提供新的指标。2.CD147拮抗肽AP—9的应用及siRNA技术沉默CD147基因表达均可抑制淋巴瘤细胞增殖,使其细胞表面CD147表达下降,从而降低细胞侵袭力,为短肽类物质应用于临床及以CD147为靶点的基因治疗提供了实验依据