论文摘要
前言肥胖与2型糖尿病、心血管系统疾病的发生发展密切相关,在全世界的患病率逐年上升。对于其密切关系的分子机制目前还不十分清楚,但研究发现脂肪组织作为内分泌器官,分泌多种脂肪细胞因子,如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、C-反应蛋白（CRP）、抵抗素（resistin）、脂联素（adiponectin）等,在肥胖相关的心血管系统疾病的发生发展中发挥了极其重要的作用。越来越多的证据表明脂肪细胞因子通过促炎症反应的作用直接影响到内皮细胞功能。虽然大部分的数据都是基于体外的研究得来的,但我们可以用脂肪细胞因子来解释肥胖、胰岛素抵抗和内皮细胞功能失调密切相关的原因。脂肪组织的分泌产物增加可促使心血管系统疾病发生的危险性增加,但这并不依赖于脂肪细胞因子导致的胰岛素抵抗和糖尿病所产生的影响。脂肪细胞因子对血管稳态的作用各不相同,近来对于TNF-α在肥胖相关心血管系统疾病的发展中的作用较为关注。然而动物试验的研究表明TNF-a在动脉粥样硬化等心血管系统疾病的发生发展中的作用结果是不一致的。一方面敲除apoE的小鼠,TNF-α水平下降,动脉粥样硬化斑块减少,另一方面TNF-α受体P55缺失型小鼠却加速了动脉粥样硬化的形成;一方面TNF-α被认为在充血性心衰的发展过程中起到了重要作用,另一方面研究却发现在充血性心衰患者中抗TNF-α的治疗并无益处。正因为这些研究结果互相冲突,所以TNF-α在心血管系统疾病中的作用更加受到关注,抗TNF-α治疗以取得心血管保护效益的研究有待于进一步研究。纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,是纤维蛋白溶解系统主要的调节因子。PAI-1是重要的纤溶酶原活化的抑制剂,它的增加可以打乱正常的纤维蛋白清除机制而促进血栓的形成。PAI-1的水平在肥胖患者中显著升高,是心血管系统疾病发生的独立危险因素。在人体中,给予注射TNF-α可以增加PAI-1在血浆中的浓度;体外研究中,TNF-α可以增加PAI-1在内皮细胞以及脂肪细胞中的表达。因而TNF-α可通过升高PAI-1的表达而促进了血管病变的发生。最初发现早期生长反应基因-1（Egr-1）是生长因子、细胞因子、缺血、物理力量、损伤等各种刺激所引起的快速反应的早期基因,所有的刺激均与血管疾病的进展相关。McCaffrey的研究表明Egr-1在血管损伤后所导致的动脉粥样硬化处表达升高,用Egr-1的反义技术可以通过抑制平滑肌细胞移动和增殖,减少动脉粥样硬化处Egr-1的表达。在巨噬细胞中的研究发现,TNF-α可通过ERK1/2路径引起Egr-1表达的升高。因此本研究将检测在TNF-α作用的内皮细胞中Egr-1的表达,进一步探讨TNF-α所致心血管系统疾病发生的机制。本研究旨在探讨TNF-α对心血管系统疾病的作用及其机制。本研究检测了受试者网膜脂肪组织和皮下脂肪组织中TNF-α表达、空腹血糖、胰岛素、血脂及血浆中PAI-1的水平等临床参数,探讨TNF-α与胰岛素抵抗、血脂异常症和心血管系统疾病之间的关系。并进行了体外试验,观察TNF-α对内皮细胞中Egr-1蛋白表达的影响,探讨TNF-α引起心血管系统疾病的机制。材料与方法1、选取进行腹部外科手术的肥胖患者和正常体重的对照组患者,进行常规指标的测定,包括体重、身高、腰围。2、采用酶学方法测定血糖、血胆固醇、血高密度脂蛋白胆固醇水平;采用化学发光免疫分析法测定胰岛素、C肽水平。计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）:HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。3、采用免疫组化方法和western blot方法检测受试者腹部皮下脂肪和网膜脂肪中TNF-α的表达。4、ELISA方法检测受试者血清中PAI-1的水平。5、采用人脐静脉内皮细胞株培养的方法,TNF-α和/或葡萄糖与内皮细胞共同孵育,收集内皮细胞及细胞培养液。加入MEK抑制剂（PD98059）进行干预,收集内皮细胞及细胞培养液。6、采用western blot方法检测内皮细胞中Egr-1、ERK1/2蛋白的表达。7、采用ELISA方法测定各组细胞培养液中PAI-1水平。结果1、男性和女性受试者测量和代谢指标的数据表明无论在男性还是女性组,肥胖者BMI、腰围、空腹胰岛素水平、HOMA-IR、甘油三酯、胆固醇和血浆PAI-1水平均高于正常对照组,而HDL-C水平低于正常对照组。2、肥胖组网膜脂肪和皮下脂肪标本中TNF-α蛋白水平均高于正常对照组。3、在女性肥胖受试者中两处脂肪细胞的大小与其对应的TNF-α的表达呈正相关（γ=0.779,P＜0.01,网膜脂肪处;γ=0.452,P＜0.05,皮下脂肪处）。在男性肥胖受试者中,仅在网膜脂肪处两者成正相关（γ=0.828,P＜0.01）。4、在女性肥胖受试者中,网膜脂肪细胞TNF-α的表达与空腹血糖浓度呈正相关（γ=0.541,P＜0.05）,与空腹胰岛素呈正相关（γ=0.599,P＜0.01）,与胰岛素抵抗指数呈正相关（γ=0.546,P＜0.05）,与甘油三酯呈显著正相关（γ=0.469,P＜0.05）,与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关（γ=-0.759,P＜0.01）。这些参数与皮下脂肪TNF-α表达不相关。在男性肥胖组中,两处脂肪TNF-α的表达与HOMA-IR均无明显相关,但网膜脂肪TNF-α表达与葡萄糖水平正相关（γ=0.762,P＜0.01）,与胰岛素水平正相关（γ=0.622,P＜0.05）,与甘油三酯水平正相关（γ=0.650,P＜0.05）,与高密度脂蛋白胆固醇水平负相关（γ=-0.880,P＜0.01）。男性肥胖受试者中皮下脂肪TNF-α的表达与葡萄糖、胰岛素、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇水平无明显相关性。5、在女性和男性肥胖受试者中,可见网膜脂肪TNF-α蛋白的表达水平与血浆PAI-1水平呈显著正相关（女性:n=20,γ=0.763,P＜0.01;男性:n=12,γ=0.760,P＜0.01）。6、25mmol/1葡萄糖、10ng/ml TNF-α使Egr-1水平的变化如下:TNF-α使Egr-1升高后即回落,高峰在60分钟,葡萄糖使Egr-1表达的高峰亦在60分钟,但Egr-1的表达持续升高直至240分钟。7、葡萄糖与TNF-α共同孵育的内皮细胞Egr-1表达较葡萄糖和TNF-α单独作用升高分别达2.64倍、2.34倍（P＜0.05）,比其单独作用都要高,说明葡萄糖和TNF-α对Egr-1的表达的影响具有协同作用。8、细胞与PD98059（20μmol/1）孵育后各组Egr-1的表达较空白对照组、葡萄糖孵育组和TNF-α孵育组Egr-1蛋白表达分别降低16.92%、13.99%、63.08%（P＜0.05）。10ng/ml TNF-α可以使25mmol/1葡萄糖孵育的ERK1/2水平升高1.76倍（P＜0.05）,25mmol/1葡萄糖加入到10ng/ml TNF-α孵育后的内皮细胞中,葡萄糖不能提高ERK1/2的活性（P＞0.05）。9、25mmol/1葡萄糖、10ng/ml TNF-α可使内皮细胞培养液中PAI-1水平升高,与PD98059孵育后葡萄糖组和TNF-α组PAI-1水平分别降低了30.43%、66.67%（P＜0.05）。讨论肥胖根据脂肪组织分布的位置不同而分为中心型肥胖和外周型肥胖。中心型肥胖即内脏型肥胖,是指脂肪堆积在大网膜和肠系膜的脂肪处。外周型肥胖,通常是指皮下脂肪的堆积。流行病学研究发现,肥胖相关的并发症,如胰岛素抵抗、2型糖尿病、血脂异常症、心血管系统疾病等,与内脏型肥胖的关系更加密切,但其机制目前还不十分清楚。分子水平的研究发现,内脏脂肪表达的IL-6、IL-8、PAI-1、血管紧张素原等均高于皮下脂肪,因而很可能是由于内脏脂肪不同的生物学性质,引起了中心型肥胖相关疾病的发生。近年来,关于脂肪组织源性TNF-α在肥胖相关胰岛素抵抗中的作用的研究备受瞩目。TNF-α在肥胖的人类和啮齿动物的脂肪组织中均有表达,是研究所发现的第一个与肥胖胰岛素抵抗密切相关的脂肪因子。本研究发现网膜脂肪TNF-α蛋白表达高于皮下脂肪细胞,与Alessi MC等的研究发现网膜脂肪中TNF-αmRNA的表达高于皮下脂肪这一结果相一致,支持内脏脂肪堆积与并发症出现更相关这一观点。脂肪细胞的大小是细胞因子合成的一个重要的决定因素,Gabor Winkler等报道脂肪细胞的大小是TNF-α产生和胰岛素抵抗的决定因素。本研究测定了两处脂肪细胞的大小,结果显示网膜脂肪细胞小于皮下脂肪细胞。在两处脂肪细胞中,脂肪细胞的大小与TNF-α表达呈正相关,这一结果与受试者的代谢状况或是各种激素、因子的不同无关,因为两处脂肪来源于同一受试者。因而,脂肪细胞大胁皇蔷龆═NF-α表达的唯一决定因素,TNF-α的表达还决定于脂肪组织所处的解剖位置。网膜脂肪TNF-α蛋白与胰岛素抵抗指数呈正相关,这与Sada KE的报道相一致,说明TNF-α在内脏脂肪堆积引发胰岛素抵抗的过程中起重要作用。本研究还发现网膜脂肪组织表达的TNF-α与甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇密切相关。已有研究发现内脏脂肪比皮下脂肪的脂解能力要强,本研究进一步支持这一观点。网膜脂肪可通过分泌TNF-α而促进脂解,使游离脂肪酸增加,进一步促进了胰岛素抵抗、血脂异常症以及心血管系统疾病的发生。纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,是纤维蛋白溶解系统主要的调节因子。PAI-1是重要的纤溶酶原活化的抑制剂,它的增加可以打乱正常的纤维蛋白清除机制而促进血栓的形成。PAI-1在肥胖患者中水平显著升高,是心血管系统疾病发生的独立危险因素。网膜脂肪TNF-α的表达与血浆PAI-1水平的显著相关,表明了网膜脂肪TNF-α在肥胖相关心血管系统疾病的发生中起到了重要的作用。TNF-α可促进脂肪细胞、内皮细胞表达PAI-1,使血浆中PAI-1的水平升高,从而增加了心血管系统疾病发生的危险性。血糖和TNF-α不同水平对Egr-1表达的影响研究结果表明,TNF-α、高葡萄糖均可增加Egr-1的表达,且二者可协同作用增加Egr-1的表达。TNF-α可活化内皮细胞中ERK1/2和Egr-1的表达,并且TNF-α依赖于ERK1/2途径诱导Egr-1在内皮细胞中的表达。Egr-1最初被发现是各种刺激包括生长因子、细胞因子、缺血、物理力量、损伤等所快速引起反应的早期基因,所有的刺激均与血管疾病的进展相关。TNF-α依赖于ERK1/2途径调节HUVEC中Egr-1的表达,这一结果与胰岛素通过ERK1/2途径介导鼠肾小球血管内皮细胞Egr-1的表达是相同的。Egr-1是促有丝分裂信号途径重要的介导因子,用Egr-1的反义技术可以通过减少动脉粥样硬化处Egr-1的表达抑制SMC移动和增殖。McCaffrey的研究表明Egr-1在血管损伤后所导致的动脉粥样硬化处表达升高,Egr-1是血管内皮受损后功能变化的重要介导因子。因而在肥胖患者高表达的TNF-α可能通过升高Egr-1在内皮细胞的表达,从而介导了心血管系统疾病的发生。TNF-α依赖ERK1/2路径介导Egr-1的表达,因而ERK1/2路径在血管病变发生中起到了重要作用,研究表明接受ERK1/2的反义治疗可减少动脉粥样硬化的形成。ERK1/2可以调节细胞的生长分化和增殖,还与动脉粥样硬化的改变密切相关,抑制ERK1/2路径是可以达到保护心血管的效益的,但同时也可能扰乱正常细胞的生长分化和增殖。本实验用到的是MEK抑制剂,目前尚无特异性选择ERK1/2的抑制剂应用于临床。虽然MEK抑制剂可以抑制葡萄糖诱导的Egr-1的表达,但葡萄糖不能增加TNF-α引起的ERK1/2的活化,数据表明葡萄糖诱导的Egr-1的表达可能并不依赖于ERK1/2的活化。研究显示葡萄糖诱导Egr-1可能是通过PKC路径实现的。由此推测,MEK抑制剂可能抑制了其他信号途径如PKC路径,从而使葡萄糖诱导的Egr-1表达下降。结果表明TNF-α和葡萄糖以不同的方式调节Egr-1表达,葡萄糖通过经典PKC依赖途径,TNF-α通过ERK1/2途径介导Egr-1表达。因而,TNF-α在内脏脂肪的堆积与胰岛素抵抗、血脂异常症等相关疾病的发生中起到了中心介质的作用。对于其进一步分子机制的研究将有益于中心型肥胖患者并发症的预防和治疗策略的制定。本研究表明了Egr-1在血管并发症中重要的中心环节作用,以及在动脉粥样硬化形成过程中的重要意义。TNF-α和葡萄糖使血管内皮细胞Egr-1上调是糖尿病发生血管并发症的初始事件,对以后在这一环节进行抑制从而达到治疗血管并发症的作用提供了重要的理论支持。结论1、肥胖者网膜脂肪处TNF-α蛋白水平的高表达与肥胖相关胰岛素抵抗、心血管系统疾病等并发症的发生密切相关。2、网膜脂肪可通过分泌TNF-α而促进脂解,使游离脂肪酸增加,进一步促进了胰岛素抵抗、血脂异常症以及心血管系统疾病的发生。TNF-α还可促进脂肪细胞、内皮细胞表达PAI-1,使血浆中PAI-1的水平升高,从而增加了心血管系统疾病发生的危险性。3、TNF-α可活化内皮细胞中ERK1/2和Egr-1的表达,并且TNF-α部分依赖于ERK1/2途径诱导Egr-1在内皮细胞中的表达。
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