Zwittermicin A生物合成相关基因tzwM、tzwO的研究

论文摘要

Zwittermicin A是由蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus，Bc）和苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）产生的一种新型广谱的抗生素，是已知唯一的线性氨基多元醇类抗生素，该抗生素对多种真核微生物和原核微生物有抑制作用，而且该抗生素与Bt毒素共同使用能显著提高Bt杀虫活性。基于以上特点，使得Zwittermicin A生物合成基因簇的研究成为该研究领域的热点之一。2004年，Emmert等从Bc菌株UW85中克隆了16kb的Zwittermicin A生物合成基因簇，其中包括，Zwittermicin A抗性基因（zmaR）在内的九个完整的开放阅读框（ORFs，它们的顺序为orf3、orf1、zmaR、orf2、orf4、orf5…orf8）和一个不完整的开放阅读框orf9。Bt菌株G03对鳞翅目害虫具有高毒力，高产Zwittermicin A，有很高的抑菌活性。本研究室在已发表的Zwittermicin A合成基因簇基础上，在G03中发现了完整的orf9（本研究命名为tzwM），同时还发现了5个新的开放阅读框，3个位于已发表序列的上游，命名为tzwA、tzwB、tzwC，2个位于已发表序列的下游，命名为tzwN和tzwO。本研究对tzwM和tzwO序列进行测定并推测了其氨基酸序列，tzwM长度为1，074 bp，编码的蛋白分子量为40.5 kDa，TzwM与各种细菌的链烷磺酸盐单加氧酶有同源性；tzwO长度为1，077bp，编码的蛋白分子量为42.0 kDa，TzwO与FkbH（FkbH参与FK520抗生素合成所需的甲氧基丙二酸单酰基-ACP的合成）有较高的同源性。本研究分别克隆了tzwM和tzwO的全长基因，并在大肠杆菌BL21中进行了融合表达及纯化。通过等位基因交换的方法，构建了tzwM基因突变盒M和tzwO基因突变盒O，分别将其插入温度敏感的E.coli-Bt穿梭载体pRN5101得到突变质粒pRNM和pRNO。导入产Zwittermicin A的Bt菌株G03，经高温突变分别获得tzwM、tzwO的突变株各3株，将tzwM的突变株命名：G03△tzwM-101，G03△tzwM-140和G03△tzwM-262，将tzwO的突变体命名为：G03△tzwO-89，G03△tzwO-144和G03△tzwO-184。运用Southern blotting的方法，分别验证了突变体G03△tzwM-101和G03△tzwO-184的正确性；通过其对欧文氏杆菌的抑菌活性表明各突变株均丧失了抑菌活性；质谱分析未检测到Zwittermicin A；对突变体进行基因互补，又使其恢复了抑菌活性。表明tzwM、tzwO是Zwittermicin A合成所必需的。这为Zwittermicin A合成途径的解析提供了重要线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌概述
• 1.2 Zwittermicin A的研究进展
• 1.2.1 Zwittermicin A的发现、结构及活性
• 1.2.2 影响Zwittermicin A积累的因素及Zwittermicin A的纯化
• 1.2.3 Zwittermicin A的抑菌机制
• 1.2.4 Zwittermicin A抗性基因的克隆及抗性机理的研究
• 1.2.5 产Zwittermicin A菌株的筛选
• 1.2.6 Zwittermicin A生物合成基因簇的研究
• 1.2.7 Zwittermicn A生物合成基因簇的定位
• 1.3 微生物基因敲除技术概述
• 1.3.1 基因敲除的概念及技术要点
• 1.3.2 微生物基因敲除的技术要点
• 1.3.3 基因敲除技术的应用
• 1.4 立题依据及目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 模板的制备
• 2.2.2 PCR反应
• 2.2.3 酶切反应
• 2.2.4 E.coli质粒DNA提取
• 2.2.5 Bt质粒DNA的提取
• 2.2.6 Bt总DNA的提取
• 2.2.7 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.8 目的DNA的回收
• 2.2.9 DNA片段的连接
• 2.7.10 E.coli热击感受态细胞的制备
• 2.2.11 质粒热击转化E.coli
• 2.2.12 序列测定及分析
• 2.2.13 E.coli电击感受态细胞的制备
• 2.2.14 E.coli电击转化方法
• 2.2.15 Bt感受态细胞的制备
• 2.2.16 Bt电击转化
• 2.2.17 E.coli重组蛋白的提取
• 2.2.18 E.coli重组蛋白的纯化
• 2.2.19 同源重组突变体的获得
• 2.2.20 Southern blotting验证
• 2.2.21 菌株抑菌活性的测定
• 3 实验结果
• 3.1 tzwM基因的研究
• 3.1.1 tzwM基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化分析
• 3.1.2 tzwM基因敲除突变体的获得
• 3.1.3 tzwM基因敲除突变体的生物特性研究
• 3.1.4 tzwM基因敲除突变体的恢复
• 3.2 tzwO基因的研究
• 3.2.1 tzwO基因在大肠杆菌中的诱导表达及纯化分析
• 3.2.2 tzwO基因敲除突变体的获得
• 3.2.3 tzwO基因敲除突变体的生物学特性研究
• 3.2.4 tzwO基因突变体的恢复
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 在读期间发表的学术论文
• 8 作者简历
• 9 致谢
• 附发表文章