糙皮侧耳Po.Hyd基因超表达载体的构建及转化研究

论文摘要

真菌疏水蛋白是一类具有强农面活性的分泌型小分子量蛋白质,是高等丝状真菌在特定时期分泌的一类特殊的蛋白质,它同时具有亲水和疏水结构,当遇到两相界面时能自我装配成两亲性薄膜。真菌疏水蛋白在真菌生长发育的一些特殊时期会高度表达,具有特定的生物学功能,可被应用于食品、医疗等许多领域。因此,研究疏水蛋白基因具有重要意义。本研究构建了糙皮侧耳子实体特异疏水蛋白基因Po.Hyd的超表达Ti载体pPHOEx,利用根癌农杆菌转化野生型菌丝得到转化子,并对转化子进行检测和分析,具体研究结果如下：1、成功构建了Po.Hyd超表达Ti载体pPHOEx,并进行转化,筛选得到12个拟转化子；2、利用特异PCR检测12个拟转化子,其中7个转化子检测结果呈阳性,将这7个转化子分别命名为G1～G7；3、对转化子进行Southern杂交分析,结果显示T-DNA在转化子中均为单拷贝的随机整合；4、对转化子进行RAPD分析,13个随机引物共检测到111个位点,其中多态位点有44个,多态位点比率为39.64%,DNA多态性指数为56.63；5、对转化子进行实时定量PCR分析,转化子菌丝中基因Po.Hyd的表达量有不同程度的增加；6、对转化子进行同工酶分析,结果为：转化子的酯酶与过氧化物酶谱带都存在一定的差异；7、荧光显微镜镜检结果显示,所有的转化子菌丝都可以观察到绿色荧光蛋白的表达；8、转化子菌丝的生长速度不同,子实体的形态也有一些差异；9、利用SEFA-PCR成功克隆得到子实体特异疏水蛋白基因Po.Hyd的启动子序列。

论文目录

• 缩略语表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 真菌疏水蛋白
• 1.1 疏水蛋白概述
• 1.2 真菌疏水蛋白的种类与分布
• 1.3 真菌疏水蛋白的生物学功能
• 1.4 真菌疏水蛋白的应用
• 1.5 真菌疏水蛋白基因
• 2 基因功能的研究方法
• 2.1 基因功能研究的策略
• 2.1.1 基因的生物信息学分析
• 2.1.2 基因的时空表达谱分析
• 2.1.3 基因功能的实验策略
• 2.1.4 基因编码产物相互作用蛋白的研究策略
• 2.2 真菌基因功能的研究方法
• 2.2.1 转座子标签技术
• 2.2.2 基于核酸的基因沉默技术
• 2.2.3 基因敲除技术
• 2.2.4 超表达技术
• 2.2.5 酵母单/双杂交技术
• 2.2.6 T-DNA标签技术
• 2.2.7 基因诱捕技术
• 2.2.8 基因表达序列分析技术
• 2.2.9 微阵列分析技术
• 2.3 超表达在真菌基因功能研究中的应用
• 3 转基因菌株的检测分析方法
• 3.1 SOUTHERN BLOT分析
• 3.2 RAPD分析
• 3.3 实时荧光定量PCR
• 3.4 同工酶分析
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 实验菌株
• 1.2 质粒载体
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 主要溶液的配制
• 1.5.1 抗生素储液
• 1.5.2 DNA提取缓冲液
• 1.5.3 Southern杂交缓冲液
• 1.5.4 同工酶染色液
• 1.6 培养基
• 1.6.1 LB液体培养基
• 1.6.2 YEB培养基
• 1.6.3 农杆菌基本培养基（MM）
• 1.6.4 农杆菌诱导培养基（IM）
• 1.6.5 共培养培养基（Co-CM）
• 1.6.6 选择培养基（SM）
• 2 实验方法
• 2.1 DNA与RNA相关操作
• 2.1.1 基因组DNA的提取
• 2.1.2 DNA的浓缩
• 2.1.3 基因组RNA的提取
• 2.1.4 反转录合成cDNA第一链
• 2.2 基因克隆相关操作
• 2.2.1 PCR
• 2.2.2 DNA的酶切
• 2.2.3 酶切片段的去磷酸化
• 2.2.4 酶切片段的酶连
• 2.2.5 DNA凝胶回收
• 2.2.6 质粒的抽提
• 2.3 转化
• 2.3.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 2.3.2 E.coli DH5α转化
• 2.3.3 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.4 根癌农杆菌电转化
• 2.4 基因Po.Hyd过表达TI载体的构建
• 2.4.1 过表达Ti载体骨架的构建
• 2.4.2 Po.Hyd基因的克隆
• 2.4.3 基因片段与骨架的连接
• 2.5 基因Po.Hyd启动子的克隆
• 2.6 根癌农杆菌介导糙皮侧耳的转化
• 2.6.1 根癌农杆菌毒性的诱导
• 2.6.2 以糙皮侧耳菌丝为受体的转化
• 2.7 转化子的检测与分析
• 2.7.1 转化子稳定性检测
• 2.7.2 PCR检测
• 2.7.3 Southern杂交检测
• 2.7.4 转化子基因组DNA的多态性分析
• 2.7.5 转化子菌株的同工酶分析
• 2.7.6 转化子的实时荧光定量PCR分析
• 2.7.7 转化子菌丝的荧光镜检
• 2.7.8 出菇实验
• 第三章 结果与分析
• 1 超表达载体构建结果
• 1.1 gpd基因启动子的克隆结果
• 1.2 gpd基因终止子的克隆结果
• 1.3 Po.Hyd基因的克隆结果
• 1.4 超表达载体构建结果
• 2 超表达转化子的检测结果
• 2.1 特异PCR检测结果
• 2.2 Southern杂交检测结果
• 2.3 转化子基因组DNA的多态性分析结果
• 2.4 转化子菌株同工酶分析结果
• 2.4.1 酯酶同工酶检测结果
• 2.4.2 过氧化物酶同工酶检测结果
• 2.5 转化子实时荧光定量分析结果
• 2.6 转化子菌丝形态的观察
• 2.7 转化子菌丝镜检的结果
• 2.8 出菇实验结果
• 3 基因Po.Hyd启动子的克隆结果
• 第四章 讨论与结论
• 1 疏水蛋白基因
• 2 超表达与RNA干涉
• 3 基因启动子研究
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录