太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）三倍体诱导剂6-DMAP的安全性评价

论文摘要

贝类养殖具有食物链短、定居性强、育苗和养殖基础好、成本相对较低等特点,已成为我国沿海地区海水养殖的重要支柱产业之一。而三倍体贝类由于育性差、生长快、品质好等诸多优点成为贝类养殖中重点,三倍体育种技术已在太平洋牡蛎等主要经济贝类中进行了产业化推广应用。诱导多倍体的方法很多,其中6-DMAP由于其低毒、高效、价廉等特点,在三倍体育种生产中应用最为广泛。但6-DMAP的环境残留问题不容忽视,使用完后如果未经处理,一旦通过水体进入海洋中,就有可能影响海洋生物,再通过食物链（网）产生生物放大效应后威胁人体健康,且国内外对6-DMAP安全性问题报道较少。因此,本文以6-DMAP为研究对象,通过活体（in vivo）和离体（in vitro）实验进行6-DMAP的安全性评价。研究结果表明:（1） 6-DMAP影响太平洋牡蛎三倍体受精与早期发育过程并对生长发育产生不利影响。用600 mM 6-DMAP处理太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）15 min,6-DMAP对三倍体受精与早期发育过程中细胞超微结构影响表现为:线粒体轻微变形,部分线粒体有内嵴溶解现象并可见局部形成低电子密度区;卵黄量大且电子密度较高,部分卵黄变形,少数卵黄中出现少量空白区且有轻微变形;内质网轻微肿胀,部分核糖体脱落;局部核膜变形,伴有轻微溶解;2-8细胞期核膜呈现轻微水肿,线粒体内嵴溶解较为明显。（2） 6-DMAP对细胞间紧密连接具有拉开作用,增加了细胞膜通透性。6μM、300μM和3000μM三个浓度6-DMAP处理Caco-2细胞,其TEER值随作用时间增加显著减小。（3） 6-DMAP可能具有类雌激素活性。93.75μM、187.5μM、375μM、750μM、1500μM的6-DMAP均能引起MCF-7的显著增殖,3000μM 6-DMAP极显著促进MCF-7增殖。（4） 6-DMAP可能具有潜在的致癌性。500μM的6-DMAP处理组显著抑制Balb/c3t3 A31细胞DNA合成,1000μM的6-DMAP处理组DNA合成数量极显著下降。随着6-DMAP浓度的增加,DNA合成数目逐渐减少,对Balb/c3t3 A31细胞DNA合成的阻碍作用增强,增加了细胞恶性转化的机率。（5） 6-DMAP对神经分化有促进作用,但同时抑制AChE活性,具有影响神经传递和调控的作用。经6-DMAP处理,1250μM处理组的PC12细胞神经突起生长状况与NGF组基本相同,但500μM、750μM、1000μM、1250μM6-DMAP处理组均抑制PC12细胞AChE活性,并且随着浓度增加抑制率逐渐升高。综合以上实验结果表明6-DMAP能够影响细胞正常结构和生长发育,并可能具有类雌激素活性和潜在致癌性,同时对神经传递和调控起一定作用,但对其可能产生的危害及作用机理仍需进一步深入研究,并建议现阶段生产过程中,6-DMAP使用后应予以回收、重复利用,防止进入环境,威胁人体健康。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 贝类多倍体诱导剂6-DMAP 的安全性评价研究进展
• 1.1 6- DMAP 在贝类多倍体育种中的应用
• 1.2 6- DMAP 诱导贝类多倍体的机理
• 1.3 6-DMAP 安全性评价研究进展
• 1.4 6-DMAP 安全性评价研究展望
• 1.4.1 研究路线
• 1.4.2 研究外源物质影响的重要细胞系
• 2 6-DMAP 对太平洋牡蛎细胞超微结构的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 仪器与化学药品
• 2.1.2 生物材料
• 2.1.3 6-DMAP 诱导牡蛎三倍体实验方法
• 2.1.4 电镜切片与观察
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 正常太平洋牡蛎精子
• 2.2.2 正常太平洋牡蛎卵细胞
• 2.2.3 太平洋牡蛎受精后 5 min 的受精卵
• 2.2.4 6-DMAP 诱导对太平洋牡蛎受精卵的影响
• 2.2.5 6-DMAP 诱导对太平洋牡蛎2-8 细胞的影响
• 2.2.6 6-DMAP 诱导对太平洋牡蛎D 型幼虫的影响
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 6-DMAP 对 Caco-2 细胞紧密连接的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 仪器与化学药品
• 3.1.2 生物材料
• 3.1.3 Caco-2 细胞单层培养
• 3.1.4 细胞单层跨膜电阻（TEER）测定
• 3.2 结果与分析
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 6-DMAP 对MCF-7 细胞增殖的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 仪器与化学药品
• 4.1.2 生物材料
• 4.1.3 细胞培养
• 4.1.4 MTT 法检测6-DMAP 对MCF-7 增殖的影响
• 4.1.5 统计学处理
• 4.2 结果与分析
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 5 6-DMAP 对BALB/C3T3 A31 细胞DNA 合成的影响
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 仪器与化学药品
• 5.1.2 生物材料
• 5.1.3 细胞培养
• 3H）-TDR 掺入法检测DNA 合成'>5.1.4 （³H）-TDR 掺入法检测DNA 合成
• 5.1.5 统计学处理
• 5.2 结果与分析
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 6 6-DMAP 对PC-12 细胞分化的影响
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 仪器与化学药品
• 6.1.2 生物材料
• 6.1.3 细胞培养
• 6.1.4 乙酰胆碱酯酶活性测定
• 6.1.5 PC12 细胞形态观察
• 6.1.6 统计学处理
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 6-DMAP 对PC12 细胞乙酰胆碱酯酶（ACHE）活性影响
• 6.2.2 6-DMAP 对PC12 细胞形态影响
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 7 结论
• 参考文献
• 致谢