Mut~s型重组毕赤酵母表达解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的研究

论文摘要

解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2 （YlLip2）具有很高的水解、酯化、转酯活性,在生物柴油的制备、酯合成以及对映体拆分等领域应用十分广泛。本文构建了YlLip2的Muts表型重组毕赤酵母（Pichia pastoris）表达菌株,摇瓶发酵筛选高产酶重组子,并研究了其摇瓶发酵条件,成功进行了10 L发酵罐的放大,进一步探讨了混合补料对产酶的影响。主要研究结果如下:（1）将实验室构建的载体pPICZα-lip2,电转化至P. pastoris KM71H中,得到重组菌KM71H/pPICZα-lip2,所得重组子均为Muts表型。（2）重组子经YPDS平板初筛后,转移至罗丹明B平板定性筛选,最后用摇瓶发酵定量筛选高脂肪酶活力的重组子,得到一株最高酶活力达1,080 U/mL的25#重组子。对25#重组子进行了发酵条件研究,包括甲醇浓度、pH、诱导时间、装液量、接种量;并初步研究了混合补料的影响,探讨了其可行性。（3）进行了10 L发酵罐高密度发酵,并与Mut+表型的发酵条件进行了对比。Muts表型在发酵过程中,其参数变化较为稳定。在单独甲醇补加的发酵过程中,其最高酶活力达12,000 U/mL,蛋白质含量达2.551 g/L。分别研究了甲醇与甘油、山梨醇和乳酸混合补料对YlLip2生产的影响,甲醇与其它碳源的比例为2:1。其中,甲醇与山梨醇混合补料结果最好,酶活力最高达19,800 U/mL。之后又研究了甲醇与山梨醇的混合比例对YlLip2生产的影响,其中甲醇与山梨醇以1:1混合补料的方式最佳,其酶活力达到了30,400 U/mL,是甲醇单独补加的2.53倍,生物量是甲醇单独补加的1.21倍,蛋白质含量达4.758 g/L,且发现采用甲醇与山梨醇混合补料时,色素的产生明显减少,有利于后续的分离纯化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 脂肪酶的概述
• 1.2 脂肪酶的应用
• 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展
• 1.4 解脂耶氏酵母脂肪酶YLLIP2 及其研究进展
• 1.5 本研究的目的和意义
• s型工程菌的构建'>2 Mut^s型工程菌的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• s型工程菌摇瓶发酵条件的研究'>3 Mut^s型工程菌摇瓶发酵条件的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 高密度发酵生产YlLip2 脂肪酶的初步研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 5 全文总结与展望
• 5.1 全文总结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读学位期间发表论文目录