论文摘要
目的：本实验通过艾滋病病毒包膜蛋白gp120V3环激活N9小胶质细胞和诱导原代大鼠大脑皮层神经元凋亡,模拟HIV相关神经认知障碍（HIV associated neurocognitive disorders, HAND）的主要病理改变,研究姜黄素对gp120 V3环损伤小胶质细胞和大脑皮层神经元的保护作用及机制,为防治HAND提供实验依据。方法：1 MTT法筛选姜黄素和gp120V3环剂量采用1、5、10、15、20μmol/L姜黄素为浓度梯度,与N9小胶质细胞作用24小时后,经MTT法检测细胞存活率,筛选出姜黄素安全浓度（对细胞存活率无影响浓度）。采用0.5、1、2、4mg/L gp120V3环为浓度梯度,N9小胶质细胞血清剥夺24小时后,gp120V3环与其作用24小时,经MTT法检测细胞存活率,筛选出gp120 V3环低毒剂量。2荧光显微镜定性检测N9小胶质细胞内活性氧（ROS）水平根据MTT检测结果选择姜黄素和gp120 V3环在后续实验中的剂量,其它药物的剂量主要参考已有文献获得,活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）为3mmol/L、钾通道阻断剂4-氨基吡啶（4-AP）为2mmol/L、四乙胺（TEA）为2mmol/L,实验分为10组：正常对照组、姜黄素组、NAC组、4-AP组、TEA组、gp120V3环组、gp120V3环+姜黄素组、gp120V3环+NAC组、gp120V3环+4-AP组、gp120V3环+TEA组。采用DCFH-DA探针法检测,提前2小时加入姜黄素、NAC、4-AP和TEA后,再加入gp120V3环作用1小时,装载探针后荧光显微镜观察各组荧光强度。3流式细胞仪定量检测N9小胶质细胞内ROS水平实验分组和药物剂量与荧光显微镜检测部分相同,提前2小时加入姜黄素、NAC、4-AP和TEA后,再加入gp120V3环作用1小时,马上用胰酶消化收集细胞、离心,重悬后装载DCFH-DA探针,流式细胞仪检测各组荧光强度。4荧光定量PCR检测N9小胶质细胞内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）mRNA水平实验分组和药物剂量与荧光显微镜检测部分相同,提前2小时加入姜黄素、NAC、4-AP和TEA后,再加入gp120V3环作用3小时,检测各组TNF-α和MCP-1mRNA水平。5 Hoechst33342检测原代大脑皮层神经元凋亡首先制备小胶质细胞条件培养基,实验分组为正常对照组、姜黄素组、4-AP组、TEA组、gp120 V3环组、gp120 V3环+姜黄素组、gp120 V3环+4-AP组和gp120 V3环+TEA组,小胶质细胞血清剥夺24小时后,提前2小时加入姜黄素、4-AP和TEA,再加入gp120V3环作用12小时取细胞上清即为条件培养基。Hoechst33342检测实验分组与上述制备条件培养基分组相同,各组加入上述相应条件培养基作用24小时后染色,荧光显微镜观察各组大脑皮层神经元细胞核形态变化。6全细胞膜片钳检测姜黄素对gp120V3环所致原代大脑皮层神经元电压门控性钾通道电流改变的影响实验分组为正常对照组、gp120V3环组和gp120V3环+姜黄素组,将细胞钳制在-80mV,给予从-60mY到+60mV的阶梯去极化脉冲刺激,步阶为10mV,通过改变电极外液成分分别检测瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流,观察姜黄素对gp120V3环所致电压门控性钾电流变化的影响。结果：1 MTT检测提示1、5、10、15μmol/L姜黄素对细胞存活率无影响,而20μmol/L姜黄素使细胞存活率降至（59.64±4.05）%（p<0.05）,对细胞产生毒性,故本实验采用15μmol/L姜黄素。0.5mg/L gp120V3环对细胞存活率无影响,而1、2.4mg/Lgp120V3环使细胞存活率分别降至（82.08±2.95）%、（69.53±1.07）%、（60.48±0.59）%（p<0.05）,对细胞产生毒性,实验中选用低毒剂量lmg/L。2经荧光显微镜检测,与正常对照组相比,lmg/L gp120V3环使小胶质细胞活性氧荧光强度明显增强,而姜黄素、NAC、4-AP和TEA均可明显减弱gp120V3环引起的活性氧荧光增强。3经流式细胞仪检测,gp120V3环组小胶质细胞内活性氧相对水平增高,gp120V3环+姜黄素组、gp120V3环+NAC组、gp120V3环+4-AP组和gpl20V3环+TEA组活性氧相对水平降低,与gp120V3环组相比,差异有统计学意义（p<0.05）。4荧光定量PCR检测TNF-α和MCP-1 mRNA水平,结果显示：gp120V3环组TNF-α和MCP-1mRNA表达水平升高,与正常对照组相比,差异有统计学意义（p<0.05）；姜黄素组、NAC组、4-AP组和TEA组TNF-α和MCP-1 mRNA表达水平均降低,与正常对照组相比,差异有统计学意义（p<0.05）。与gp120V3环组相比,gp120V3环+姜黄素组、gp120V3环+NAC组、gp120V3环+4-AP组和gp120V3环+TEA组,TNF-α和MCP-1 mRNA表达水平均降低,差异有统计学意义（p<0.05）。5 Hoechst33342检测姜黄素对gp120V3环所致大鼠大脑皮层神经元细胞核形态变化的影响正常对照组神经元细胞核为均匀淡蓝色,gp120V3环组见较多细胞核染成高亮蓝色,示细胞处于凋亡状态；与gp120V3环组相比,gp120V3环+姜黄素组、gp120V3环+4-AP组和gp120V3环+TEA组均可见胞核染成高亮蓝色细胞明显减少。6全细胞膜片钳检测姜黄素对gp120V3环所致大鼠大脑皮层神经元延迟整流和瞬时外向钾电流变化的影响向浴液加入gp120V3环后延迟整流和瞬时外向钾电流不同钳制电压峰值均增大,与正常对照组相比,差异有统计学意义（p<0.05）；与gp120V3环组相比,加入姜黄素后延迟整流和瞬时外向钾电流不同钳制电压峰值均减低,差异有统计学意义（p＜0.05）。结论：1 gp120V3环可引起小胶质细胞内活性氧水平、TNF-α和MCP-1基因表达升高,钾通道阻断剂4-AP、TEA和活性氧清除剂NAC可减轻gp120V3环引起的上述升高,提示gp120V3环可能通过作用于电压门控性钾通道引起活性氧水平升高,活性氧升高进一步引起炎性细胞因子表达升高,此为gp120V3环激活小胶质细胞释放炎性因子的可能机制。姜黄素明显下调gp120V3环引起的小胶质细胞内活性氧水平、TNF-α和MCP-1基因表达升高,对gp120V3环引起的小胶质细胞激活有保护作用。2 gp120V3环可引起大脑皮层神经元凋亡,姜黄素、钾通道阻断剂4-AP和TEA可减轻gp120V3环引起的神经元凋亡；gp120V3环可引起大脑皮层神经元延迟整流和瞬时整流钾电流增强,姜黄素可减轻gp120V3环引起的钾电流增强,提示gp120V3可能通过增强电压门控性钾通道电流诱导神经元凋亡,姜黄素可减弱电压门控性钾电流,保护神经元免于凋亡综上所述,gp120V3环通过作用于电压门控性钾通道引起活性氧水平、TNF-αmRNA、MCP-1 mRNA升高和诱导大脑皮层神经元凋亡。姜黄素对gp120V3环引起的小胶质细胞激活和大脑皮层神经元凋亡有保护作用,姜黄素保护神经元免于凋亡的可能机制是减弱gp120V3环引起的电压门控性钾电流增强。
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相关论文文献
- [1].HIV-1膜蛋白gp120V3环的神经毒性研究[J]. 首都医科大学学报 2014(01)
标签：姜黄素论文; 小胶质细胞论文; 大脑皮层神经元论文; 活性氧论文; 电压门控性钾通道论文;