伪狂犬病病毒细菌人工染色体的构建及应用

论文摘要

伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）的分类学名称是猪疱疹病毒1型（suid herpesvirus 1），最早的名称是奥耶兹氏病病毒（Aujeszky’s disease virus）。PRV属于α-疱疹病毒亚科，引起猪的伪狂犬病（Pseudorabies）。该病曾经在世界范围内广泛流行，造成巨大的经济损失。PRV受到病毒学家、神经生物学家及疾病预防控制专家的密切关注。虽然美国和欧洲很好的实施了PRV的根除计划，但是许多国家仍然存在PRV的地方性流行。PRV对人类不易感，而且研究方法相对成熟，因此在疱疹病毒生物学的研究中PRV是非常好的模式生物。分子生物学技术常被用来研究病毒基因编码产物的功能。最基本的研究单个基因功能的方法是突变。通常构建突变体病毒的基本方法是同源重组，这需要将病毒基因组与设计好的转移载体共转染真核细胞，然后经过数轮空斑纯化得到重组病毒。如果需要缺失或突变的基因是病毒正常增殖所必需，那么用这种方法无法得到重组体。为了克服以上缺点，有一些实验室已经将完整的疱疹病毒基因组克隆入大肠杆菌。由于疱疹病毒基因组较大，这些克隆有的是一系列互相重叠的粘粒载体（Cosmid）或者是基于F质粒的基因组单拷贝。基于大肠杆菌F质粒的全基因组克隆，转染合适的真核细胞后不需要进行基因修复或重组。而且，由于在哺乳动物基因组文库构建中，克隆的大片段DNA在大肠杆菌中十分稳定，所以基于F质粒的克隆技术已经被广泛接受。因此，基于F质粒构建疱疹病毒全基因组克隆有如下优点：1、在大肠杆菌中稳定；2、可以利用大肠杆菌遗传学的方法；3、转染真核细胞后不需要基因修复或者同源重组就能得到子代病毒。Cre／loxP位点特异性重组系统具有位点特异、时期特异、组织特异和高效重组的特点，可广泛用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物的体内、体外基因重组。Cre和loxP均来自于P1噬菌体，其介导的基因重组不需要其他蛋白质或辅助因子参与，仅需纳摩尔的量即可与loxP位点结合，完成体内或体外的DNA的重组，将外源基因定点整合到染色体上或将特定的DNA片段删除；Cre／loxP重组系统在基因靶位操作、基因功能地鉴定、外源基因的整合等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。本研究结合这些最新发展的技术，成功构建了PRV的全基因组细菌人工染色体克隆。表达绿色荧光蛋白及包含LoxP位点的重组伪狂犬病病毒的构建：根据pEGFP-C1序列，设计并合成一对引物，PCR扩增出两端各舍一个同向loxP位点的GFP表达盒并克隆于转移载体pSKLR。将获得的转移载体pSKLR-G-loxP转染293T细胞后再感染PRV容A株病毒。利用5’-溴-2’-脱氧尿嘧啶（BrdU），在TK-143细胞上筛选出表达GFP的TK基因缺失的重组毒株S03109。PCR、Western Blot及荧光显微镜观察结果表明，S03109能够正确表达GFP。病毒生长曲线测定结果表明，S03109在细胞培养上的滴度与亲本病毒相比略有下降。对小鼠半数致死量测定及免疫保护试验结果表明，S03109对小鼠的毒力大大降低，免疫小鼠后对强毒的攻击有保护作用。Cre／LoxP介导的GFP报告基因从伪狂犬病病毒基因组中的删除：将重组伪狂犬病病毒毒S03109株在转染了pOG231（表达Cre重组酶）的293T细胞上连续传代，空斑筛选得到不表达GFP的重组病毒株S0419。荧光显微镜观察、Western Blot及PCR检测结果表明，S03109感染细胞后持续表达GFP，而S0419不表达GFP。PCR证实S0419为含单个loxP位点的TK基因缺失病毒，并且在细胞培养上遗传稳定，测序结果（GenBank登录号AY822465）表明，在Cre重组酶的作用下，两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去。对BALB／c小鼠的半数致死量(LD50)及免疫保护实验结果表明，S03109和S0419对BALB／c小鼠的LD50值均大于3×105PFU，免疫BALB／c小鼠，攻毒后平均存活率分别为67.5％与70％。以上结果表明，利用Cre／LoxP位点特异性重组系统，成功去除了插入重组伪狂犬病病毒基因组中的GFP报告基因。表达Cre重组酶的真核细胞系的建立及在重组PRV研究中的应用：根据Cre基因序列，设计并合成一对引物，PCR扩增出Cre基因编码区，克隆于pIREShyg载体，得到重组质粒pIREShyg-Cre，转染BHK-21细胞后，经过400ug／mL Hygromycin B的筛选，挑选50个细胞克隆进行PCR鉴定，将其中一个阳性克隆命名为BHK-Cre。用相同的方法，以HEK-293A细胞为母本，得到表达Cre重组酶的细胞系293A-Cre。利用伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）S03109株感染BHK-Cre和293A-Cre细胞，荧光显微镜观察、PCR及Western Blot检测GFP基因的表达。结果表明，S03109感染BHK-Cre或293A-Cre三代后GFP的表达消失；PCR扩增证实第三代所获得的病毒为TK基因缺失病毒。测序结果表明，在Cre重组酶的作用下，两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去。以上结果表明，利用Cre／LoxP系统位点特异性重组的特点，通过构建稳定表达Cre重组酶的BHK-21和HEK-293A细胞系；实现了外源基因在伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）基因组中的快速去除。伪狂犬病病毒全基因组感染性克隆的构建：将重组伪狂犬病病毒S0419株感染转染了pGS275（包含BAC基本元件）的293A-Cre细胞，在RK13细胞上空斑筛选得到表达LacZ的重组病毒株S06293。X-Gal原位染色证实S06293感染细胞后表达β-半乳糖苷酶。提取S06293环化的基因组电转化入DH10B，得到PRV全基因组克隆PRV-BAC。提取PRV-BAC质粒，利用脂质体转染BHK-21细胞，得到的病毒克隆100％表达LacZ，表明全基因组的感染性克隆构建成功。利用PRV-BAC构建gE缺失的重组病毒：利用PCR分别扩增、克隆PRV RongA株US7及US9-US2区域，测序验证后亚克隆入pGS284载体，两片断正确拼接后形成同源重组臂，中部缺失US8（gE基因），得到等位交换载体pGS284-gE。将包含pGS284-gE的宿主茵cc118与包含PRV-BAC的宿主菌GS500在琼脂平板上交叉划线培养，挑取交叉点处的菌落扩大培养，经过抗生素筛选后得到PRV-BAC-gE。提取重组后的BAC质粒，转染HEK-293细胞，得到表达LacZ的gE缺失重组病毒S0645。Western Blot检测结果表明S0645不表达gE。PRV-BAC平台的建立为PRV基因功能研究及构建以PRV为载体的基因工程疫苗研究奠定了坚实的基础。利用BAC技术平台，可以实现PRV基因组中必须基因的缺失突变研究，为研制安全的基因工程疫苗及研究疱疹病毒致病机制提供了十分重要的技术手段。

论文目录

• 目录
• 全文摘要
• ABSTRACT
• 英文名称及缩写词
• 第一篇 文献综述 伪狂犬病病毒分子生物学研究进展
• 1.PRV的分子生物学
• 1.1 PRV的命名与分类地位
• 1.2 PRV的病毒粒子结构
• 1.3 PRV的基因组
• 1.3.1 PRV的保守基因
• 1.3.2 衣壳蛋白
• 1.3.3 皮层蛋白
• 1.3.4 囊膜蛋白
• 1.3.5 PRV基因的转录
• 1.4 病毒复制周期
• 1.5 潜伏性和嗜神经性
• 2.伪狂犬病的疫苗研究与根除计划
• 2.1 PRV疫苗研究进展
• 2.1.1 传统疫苗
• 2.1.2 亚单位疫苗
• 2.1.3 基因疫苗
• 2.1.4 基因缺失标记疫苗
• 2.1.5 以PRV为载体的重组疫苗
• 2.2 PRV的根除计划
• 参考文献
• 第二篇 实验研究
• 第一章 表达绿色荧光蛋白及包含LoxP位点的重组伪狂犬病病毒的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒、受体菌、毒株和细胞
• 1.2 主要试剂与材料
• 1.3 转移载体pSKLR-G-LoxP的构建
• 1.4 表达GFP的重组病毒S03109的筛选与纯化
• 1.5 S03109的鉴定
• 1.6 S03109的细胞培养特性
• 1.7 S03109对BALB／c小鼠的毒力及免疫保护作用
• 2.结果
• 2.1 转移载体pSKLR-G-LoxP的构建
• 2.2 重组病毒S03109的筛选及鉴定
• 2.3 重组病毒S03109的细胞培养特性
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第二章 Cre／LoxP介导的GFP报告基因从伪狂犬病病毒基因组中的删除
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒、受体菌、毒株和细胞
• 1.2 主要试剂与材料
• 1.3 利用Cre酶除去S03109的GFP表达盒
• 1.4 S0419的鉴定
• 1.5 S0419的细胞培养特性
• 1.6 S0419对BALB／c小鼠的毒力及免疫保护作用
• 2.结果
• 2.1 重组病毒S0419的筛选及鉴定
• 2.2 重组病毒S03109与S0419的细胞培养特性
• 2.3 S03109与S0419对BALB／c小鼠的毒力及免疫保护作用
• 3.讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第三章 表达Cre重组酶的真核细胞系的建立及在重组PRV研究中的应用
• 1 材料与方法
• 1.1 质粒、受体菌、毒株和细胞
• 1.2 主要试剂与材料
• 1.3 双顺反子载体pIREShyg-Cre的构建
• 1.4 表达Cre的BHK-21细胞系的构建及鉴定
• 1.5 PRV S03109株感染实验
• 1.6 表达Cre的HEK-293A细胞系的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 双顺反子载体pIREShyg-Cre的构建及鉴定
• 2.2 表达Cre的BHK-21细胞系的构建及鉴定
• 2.3 PRV S03109株感染试验
• 2.4 293A-Cre的构建及PRV S03109株感染试验
• 3 讨论
• 参考文献：
• Abstract
• 第四章 伪狂犬病病毒全基因组感染性克隆的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒、受体菌、毒株和细胞
• 1.2 主要试剂与材料
• 1.3 pGS275质粒的提取与293A-Cre细胞转染条件的优化
• 1.4 表达LacZ的重组病毒S06293的筛选与纯化
• 1.5 S06293的鉴定
• 1.6 S03109环化基因组的提取和电转化DH10B
• 1.7 PCR鉴定PRV-BAC
• 1.8 PRV-BAC转染真核细胞及感染性子代病毒的获得
• 1.9 S06293的细胞培养特性
• 2.结果
• 2.1 pGS275的提取与转染条件的优化
• 2.2 S06293的筛选及鉴定
• 2.3 PRV-BAC的获得及鉴定
• 2.4 S06293的细胞培养特性
• 3.讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第五章 利用PRV-BAC构建gE缺失的重组病毒
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒、受体菌、毒株和细胞
• 1.2 主要试剂与材料
• 1.3 转移载体pGS284-gE的构建
• 1.3.1 技术路线
• 1.3.2 引物设计：
• 1.3.3 PCR反应：
• 1.3.4 PCR产物纯化
• 1.3.5 限制性核酸内切酶酶切及载体的去磷酸化
• 1.3.6 酶切产物纯化与连接
• 1.3.7 感受态细胞制备与转化
• 1.3.8 质粒提取
• 1.3.9 克隆鉴定
• 1.4 等位交换修饰PRV-BAC
• 1.5 重组病毒的鉴定及生物学特性
• 2 结果与分析
• 2.1 同源重组臂的PCR克隆
• 2.2 等位交换载体pGS284-gE的构建
• 2.3 等位交换修饰PRV-BAC
• 2.4 gE缺失重组病毒S0645的获得
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 全文总结
• 致谢