以异种脱细胞角膜基质构建组织工程兔角膜前板层的实验研究

论文摘要

角膜是构成眼屈光间质的重要组成部分,同时也是重要的天然防御屏障。目前,全球约有超过1000万人承受着角膜盲的痛苦。迄今为止,同种异体角膜移植是治疗角膜盲最有效的手段。然而,由于供体材料的匮乏,远远满足不了角膜盲患者的需求。因此,寻找有效的角膜替代物用于角膜移植,是目前眼科界亟待解决的问题。早期的角膜替代物研究多集中于人工角膜（Keratoprosthesis）,有些已应用于临床,然而因生物相容性差、术后并发症较多等原因,限制了其在临床的应用。组织工程人工角膜是近年来研究热点,由种子细胞和可降解支架材料经体外构建而成,可最大程度地模仿天然角膜结构和功能。国内外已有学者采用天然或人工合成材料进行组织工程角膜构建,取得了较大进展,但因该构建物机械力学性能不足以及光学特性不佳等原因仅能用于基础研究。有报道证实,采用天然的材料如动物或人胶原制作支架可以增强其生物相容性。一些异种来源的细胞外基质己成功用于构建人工器官,如皮肤、心脏、血管等。我们课题组前期研究也证实,0.5% SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）处理的脱细胞猪角膜基质（Acellular Porcine Cornea Matrix, APCM）具有较好的透光性、力学性能、生物安全性及生物相容性,细胞及遗传物质被去除的同时,角膜的天然结构得到了良好的保留。然而,APCM能否应用于组织工程人工角膜构建并用于移植是本研究的重点和难点。鉴于角膜板层移植是治疗一些常见角膜病的有效手段,同时能够避免角膜内皮损伤和排斥,本研究主要开展了以异种脱细胞角膜支架进行组织工程兔角膜前板层构建的研究,并成功进行动物角膜板层移植,取得了较好的效果,目前国内外尚无类似研究报道。第一部分兔角膜细胞的培养及APCM的制备[目的]探讨应用无血清培养基KSFM培养兔角膜上皮、基质及内皮细胞的可行性,同时对脱细胞方法进行改良以制备APCM用于组织工程人工角膜前板层构建。[方法]1.兔角膜细胞的原代培养：无菌条件下获取新西兰大白兔眼角膜,仔细去除虹膜、结膜及多余巩膜,解剖显微镜下撕下内皮层用于组织块培养；将去内皮角膜组织置于2.4U/ml DispaseⅡ消化1h,获取角膜上皮片,经0.25%胰酶-0.02%EDTA获取上皮细胞悬液进行培养；剩余角膜基质剪碎成1mm×1mm大小,置于0.5mg/ml胶原酶I 37℃消化过夜,获取基质细胞悬液。将3种细胞各分为2组,即KSFM培养组和含10%FBS的DMEM/F12培养组,置于六孔板内培养,每种细胞每组3个孔,各接种8个板,观察各培养条件下的细胞形态,细胞计数法描记生长曲线；2. APCM的制备及去细胞效果检测：改良脱细胞制作方法,无菌条件下将处理后的新鲜猪角膜置于0.5%SDS溶液4℃振摇4h×6次,不含双抗PBS冲洗2h×8次,含双抗PBS冲洗1h×3-6次获取无菌APCM,进行以下检测：1)H.E.及DAPI检测脱细胞角膜基质内细胞及遗传物质的残留；2)MTT实验检测材料浸提液对角膜上皮、基质及内皮细胞生长曲线的影响；3)电镜观察材料的结构及有无细胞残留。[结果]1.1)KSFM组：培养2d,上皮细胞形成克隆团,基质细胞贴壁呈树枝状,内皮细胞未见爬出；培养7d,上皮细胞紧密连接呈片状（密度达到90%-100%）,基质细胞呈树枝状（密度达70-80%）,内皮细胞连接紧密,形态不规则；传代后,细胞生长缓慢或不生长,漂浮细胞较多；2)含10%FBS的DMEM/F12组：培养2d,上皮细胞形成克隆团,基质细胞呈梭形,内皮细胞可见有少量细胞爬出；培养5d,上皮呈鹅卵石样已达60%密度,基质细胞呈梭形达70-80%密度,可见大量内皮细胞从内皮片组织周边爬出,呈不规则状；上皮和基质细胞培养7d传代,内皮细胞培养10d后传代,生长状态均良好,基质细胞可传10代。KSFM培养的上皮和基质细胞的生长曲线与含血清培养基相比差异有统计学意义（P<0.05）。2.MTT实验证实APCM浸提液对角膜上皮、基质及内皮细胞生长曲线无影响（P>0.05）；H.E.及DAPI证实材料内无细胞成分残留；电镜示材料结构完整,胶原排列整齐。[结论]KSFM可用来培养角膜上皮、基质及内皮细胞,但细胞生长较缓慢,易死亡；APCM经改良的脱细胞方法处理效果良好,可用来进行组织工程人工角膜构建。第二部分组织工程兔角膜前板层的体外构建[目的]探讨以APCM为支架体外构建含角膜上皮和基质细胞的组织工程兔角膜前板层的可行性。[方法]解剖显微镜下获取含前弹力层的APCM薄片（厚约1-2mm、直径7mm）,置于培养基内37℃下浸泡24h,以备接种细胞。胰酶消化获取3代兔角膜基质细胞悬液,调整细胞终浓度为5×105/ml,应用1ml胰岛素空针平行于APCM前弹力层平面,将1ml基质细胞悬液沿着材料边缘接种于内静置培养24h,而后置于摇床上振摇培养7d；将1代角膜缘上皮细胞以5×103/mm2的密度接种于构建物表面,等待2h待细胞贴附于材料表面后,轻轻添加培养基静置再培养7d,构建同时含角膜上皮和基质细胞的组织工程兔角膜前板层。将接种基质细胞培养8d后的构建物再贴壁培养7d,观察有无细胞从角膜周边爬出,间接鉴定构建物内基质细胞活性；分别于3d、8d、15d取材进行H.E.染色,观察构建物细胞生长情况及组织结构；免疫染色检测角膜上皮细胞特异性标志物CK3和基质细胞标志物Vimentin的表达；取15d构建物标本分别进行免疫染色检查和扫描电镜观察。兔角膜前板层的三维构建过程均采用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养。[结果]构建物再贴壁培养5d,可见有大量基质细胞爬出,间接证实材料内细胞活性。H.E.染色示构建物结构完整,未见明显的结构改变,胶原纤维间隙较大：3d,可见基质内有细胞生长,密度分布不均匀,胶原排列较规则；8d,可见基质内生长大量细胞,密度较均匀,胶原纤维间隙较大,排列整齐；15d,材料内仍分布大量细胞,表达基质细胞标志物Vimentin,密度较均匀,材料表面有2-3层细胞,表达上皮细胞标志物CK3,胶原排列整齐,纤维间隙较大。扫描电镜示胶原纤维水肿膨胀明显,部分区域见有胶原纤维断裂,胶原排列较整齐,可见有梭形的基质细胞附着生长。经过100%无菌甘油脱水,构建物能够恢复透明,表明APCM经过细胞接种再培养过程,三维结构保持良好。[结论]APCM可用于组织工程人工角膜的构建；构建物具有正常兔角膜的表型,且脱水后能恢复透明,验证了该三维培养方法的可行性,为兔角膜全层和人角膜的构建奠定了实验基础。第三部分组织工程兔角膜前板层的动物移植实验[目的]初步探讨体外构建的兔角膜前板层体内移植后的生物学功能。[方法]1.5～2 kg新西兰大白兔20只随机分为两组,即构建物移植组和APCM空支架组,每组10只,各组均以右眼做术眼,左眼做阴性对照。术前3d术眼滴用抗生素,3%戊巴比妥钠（1ml/kg）经耳缘静脉进行麻醉,含庆大霉素生理盐水冲洗结膜囊,制备6.5mm直径大小角膜植床,采用国产10-0尼龙线对位缝合7mm直径大小植片至植床（共16针）,并覆盖羊膜,结膜下隔日注射庆大霉素及地塞米松,合并应用典舒眼水（3次/天）,构建物移植组术后1个月拆线。分别于1d、3d、7d、14d、21d、28d观察以下指标：结膜充血、水肿、分泌物,角膜水肿、混浊、浸润、新生血管、炎症反应,荧光素染色观察角膜上皮的完整性；术后5周进行活体共聚焦检查；于1周、2周、4周取材经4%多聚甲醛及3%戊二醛固定,分别进行组织学检查及扫描电镜观察。[结果]1.构建物移植组：术后1周,羊膜脱落,结膜轻度充血水肿,角膜上皮已覆盖大部分植片,未见有角膜新生血管,虹膜纹理可见,组织学检查见植片内胶原排列规则整齐,有少量细胞分布,植片与植床边界清晰,材料表面可见1～2层上皮细胞；术后2周,结膜轻度充血,中央角膜轻度混浊,未见有新生血管,植片表面有小部分区域上皮缺损,但可见虹膜纹理,组织学检查见材料表面分布有类似正常角膜的上皮结构,植片内部结构完整,胶原排列规则整齐,有细胞分布；术后4周,结膜充血水肿加重,植片表面不光滑,但较透明,可见角膜新生血管分布在周边区域,上皮已覆盖大部分植片,虹膜纹理可见,组织学检查同术后2周,扫描电镜示植片表面上皮排列与正常角膜已无明显差异；术后5周（已拆线1周）,结膜充血水肿消失,植片区域角膜较透明,有轻微瘢痕形成,大部分新生血管已退去,虹膜纹理清晰,植片区域可见点状荧光素着色,激光共聚焦显示术眼角膜内皮密度及形态均正常。2. APCM空支架组：术后4周内角结膜反应情况相似于构建物移植组,但上皮始终无法完全覆盖植片表面,中央角膜呈现中度混浊状态,但仍可透见虹膜。组织学检查见植片胶原排列较规则,无明显结构改变,但与受体角膜分界明显；植片表面可见有上皮细胞生长,但不同于正常上皮结构；术后3周内,材料内均无细胞分布,而在术后第4周材料内部开始出现少许细胞。术后5周（未拆线）出现植片大量溶解现象,角结膜反应较重。[结论]体外构建的兔角膜前板层可用于板层移植,具有一定的组织修复能力。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• Introduction
• 参考文献
• Part Ⅰ:Rabbit Corneal Cells Amplification and APCMs Preparation
• Materials and Methods
• Results
• Discussion
• Conclusions
• References
• Part Ⅱ:Construction of a rabbit anterior cornea replacement in vitro
• Materials and Methods
• Results
• Discussion
• Conclusions
• References
• Part Ⅲ:In Vivo Study of Rabbit Anterior Cornea Replacements
• Materials and Methods
• Results
• Discussion
• Conclusions
• References
• Reviews
• 参考文献
• Acknowledgement
• List of Published Articles and Academic Reports
• Published English Articles
• Comments on Thesis and Defense