扇贝多肽经由ROS/Fas/caspase-8通路抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡

论文摘要

目的建立UVB诱导的HaCaT细胞凋亡模型,从活性氧（ROS）、凋亡相关分子Fas（CD95）、Fas相关死亡结构域（FADD）及半胱天冬酶-8（caspase-8）的角度,研究扇贝多肽（Polypeptide from Chlamys farreri,PCF）抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡的分子机制。方法采用正交实验设计,以流式细胞仪PI染色法测定细胞凋亡率,确立UVB诱导的HaCaT细胞凋亡模型。实验设计为6组:对照组、UVB模型组、UVB+5.68 mmol·L-1维生素C阳性对照组、UVB+5.69 mmol·L-1PCF组、UVB+2.84mmol·L-1PCF组、UVB+1.42 mmol·L-1PCF组。以2,7-二氯氢化荧光素二酯（DCFH-DA）为荧光探针,检测PCF对UVB照射后细胞内ROS生成的影响;应用小干扰RNA（siRNA）干扰UVB辐射的HaCaT细胞的Fas表达;荧光染色（Hoechst33258）分析PCF对UVB诱导的HaCaT细胞凋亡的影响;琼脂糖凝胶电泳分析FassiRNA、ROS清除剂（N-acetyl-L-cysteine,NAC）及caspase-8抑制剂（z-IE7D-fmk）对细胞凋亡的影响;RT-PCR检测Fas（CD95）mRNA的表达;蛋白质印迹法检测细胞色素C（Cyto C）、FADD及caspase-8、caspase-3和多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的表达。结果正交实验结果表明,20mJ·cm-2UVB照射HaCaT细胞后18 h为最佳凋亡模型;PCF能明显抑制UVB引起的HaCaT细胞凋亡及细胞内活性氧的产生;干扰Fas及预先加入NAC和z-IETD-fmk可显著抑制UVB诱导的HaCaT细胞DNALadder的形成;1.42～5.69 mmol·L-1剂量范围内的PCF可剂量依赖性抑制UVB引起的Fas、FADD的表达、线粒体细胞色素C的释放及caspase-8、caspase-3和PARP的活化。结论PCF可抑制20mJ·cm-2UVB诱导的HaCaT细胞凋亡,其作用机制与阻断ROS—CytoC通路和Fas—FADD—caspase-8—CytoC—caspase-3—PARP通路有关。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 主要试剂和材料
• 1.3 仪器设备
• 第二章 实验方法
• 2.1 实验设计及模型建立
• 2.2 实验项目和指标检测
• 2.3 统计学处理
• 第三章 实验结果
• 3.1 UVB诱导HaCaT细胞凋亡模型的筛选
• 3.2 PCF抑制ROS的产生而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡
• 3.3 PCF抑制细胞色素C释放而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡
• 3.4 PCF抑制Fas激活而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡
• 3.5 PCF抑制FADD激活而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡
• 3.6 PCF抑制caspase-8活化而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡
• 3.7 PCF抑制caspase-3和PARP的裂解而抑制UVB诱导的HaCaT细胞
• 3.8 附图
• 第四章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述及参考文献
• 附录
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢