Sry核酸疫苗作用途径初探

论文摘要

核酸疫苗是由抗原编码基因和真核表达载体构建的重组质粒,将其导入机体后可诱导机体全面的免疫应答。与传统的蛋白免疫相比具有制作简单、经济安全、易于贮存运输等优点,自发现以来已越来越引起人们的重视,成为第三代疫苗,被广泛用于各种感染性疾病的防治研究中,我们实验室将核酸疫苗引入了性别控制领域。在性别决定和性别分化过程中,SRY/Sry基因是公认的哺乳动物性别决定基因。研究表明,基因正常表达个体就发育成雄性;相反,如果基因缺失或突变个体就发育成雌性。小鼠的性别决定发生在10.5～12.5 dpc,Sry基因也仅在此时表达。所以,性别控制可以围绕着SRY/Sry基因展开。我们实验室已经通过对小鼠进行肌肉注射Sry核酸疫苗的方法初步实现了XY胚胎向雌性反转的性别控制,获得了XY雌性个体。本实验就Sry核酸疫苗的作用途径进行了初步探索,以便对此疫苗进行更深入的研究。实验中,首先检测了核酸疫苗的体外、体内表达情况。在体外实验中,将pCR3.1-Sry瞬时转染HeLa细胞,分别用RT-PCR和间接免疫荧光法检测质粒在细胞中的表达;体内实验中,用pCR3.1-Sry肌肉注射小鼠,一周后分别提取小鼠肝脏、脾脏、肌肉、子宫组织的RNA,RT-PCR的方法检测质粒在这些组织处的表达;其次,对小鼠进行肌肉注射pCR3.1-Sry,隔一周后进行二免,二免后一周眼眶取血制备抗血清;构建pET21b-Sry重组质粒并原核表达Sry蛋白做为抗原,用夹心法ELISA对获得的抗血清进行检测。结果表明:不管在体内还是体外,核酸疫苗pCR3.1-Sry可以在真核细胞中正常表达;在肌肉注射免疫小鼠后,可以引起机体产生特异性的anti-Sry的抗体。实验结果证明:Sry核酸疫苗的确是引起了小鼠的体液免疫,其作用途径可能就是通过产生的特异性抗体与Sry蛋白结合而影响了Sry蛋白正常作用而实现性别逆转的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 绪论
• 一 哺乳动物性别决定研究的历史回顾
• 1 睾丸决定因子-TDF假说
• 2 SRY/Sry基因及其表达蛋白的研究概况
• 3 性别决定的分子机制
• 二 SRY/Sry基因在哺乳动物性别控制中的应用
• 三 核酸疫苗的发展历史
• 1 核酸免疫的研究历程
• 2 核酸免疫的免疫应答机理
• 3 核酸疫苗研制的技术路线
• 4 核酸免疫的接种途径和剂量
• 5 增强核酸疫苗效力的途径
• 6 核酸疫苗的优势
• 7 核酸疫苗的安全性
• 第二部分 本题的研究内容和意义
• 一 本题的立题依据
• 二 本题的实验内容
• 1、核酸疫苗体外表达研究
• 2、核酸疫苗的体内表达研究
• 3、核酸疫苗引起的免疫反应的研究
• 三 本题的研究目的及意义:
• 第三部分 实验部分
• （一） 材料
• （二） 方法
• 1 鉴定pCR3.1-Sry重组质粒的活性状态
• 2 制备核酸疫苗
• 3 核酸疫苗pCR3.1-Sry的体外及体内表达
• 4 Sry基因的克隆与原核表达
• 5 抗血清制备
• 6 ELISA实验
• 第四部分 结果
• 1 质粒提取及酶切验证
• 2 核酸疫苗大量制备紫外分光光度测量结果
• 3 核酸疫苗体外表达结果
• 4 核酸疫苗在体内表达结果
• 5 pET21b-Sry的构建过程
• 6 pET21b-Sry的诱导表达结果
• 7 WesternBlot实验结果
• 8 低温诱导表达Sry融合蛋白
• 9 酶联免疫吸附实验结果
• 第五部分 讨论
• 1 核酸疫苗质量的控制
• 2 免疫方案的实施
• 3 Sry基因克隆碱基缺失对其抗原性的影响
• 4 诱导表达Sry蛋白的可溶性分析
• 5 以未纯化的Sry蛋白做抗原对ELISA结果影响
• 6 核酸疫苗免疫途径的讨论
• 参考文献
• 附录
• 附录一 主要溶液的配制
• 附录二 质粒图谱
• 附录三 克隆Sry基因Genebank序列比对结果
• 附录四 pET21b-Sry重组质粒构建流程图
• 致谢