三种双生病毒及其伴随卫星DNA的致病性研究

论文摘要

双生病毒是一类世界范围内广泛发生的植物单链DNA病毒,已在多个国家和地区的作物上造成毁灭性灾害。近年来的研究发现,很多单组份双生病毒伴随有诱导典型症状所必需的卫星DNAβ分子。这类卫星DNAβ分子与其辅助病毒形成了一种新型的病害复合体,给亚洲和非洲地区的农作物生产造成了巨大损失。为了更好的了解双生病毒的致病机理,本论文围绕三种双生病毒及其卫星DNAβ的致病性进行了研究:1.与赛葵黄脉病毒相伴随的卫星DNAβ的分子变异及致病性研究目前对双生病毒伴随的卫星DNAβ的变异研究主要集中在来自不同寄主的卫星DNAβ之间,本论文则对来自我国云南省不同地区赛葵上的20个与赛葵黄脉病毒（MYVV）相伴随的卫星DNAβ进行了克隆、测序和遗传变异分析,发现这些卫星DNAβ之间虽然变异较小,但是仍然具有按地理分布聚类的特征。侵染性测定表明卫星DNAβ对于MYVV在本氏烟、心叶烟、矮牵牛和赛葵上引起典型的病害症状是必需的。进一步将MYVV与泰国番茄黄化曲叶病毒（TYLCTHV）DNAβ或中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）DNAβ共同接种本氏烟,发现MYVV可以支持异源双生病毒的卫星DNAβ在本氏烟中进行转录复制和系统移动,且病毒DNA在组织中的积累量与产生症状的严重程度呈正相关。2.中国番茄曲叶病毒及其卫星DNAβ的分子鉴定和致病性研究利用菜豆金色花叶病毒属病毒的简并引物,对从广西省采集的表现出叶片下卷等症状的番茄样品（G16、G17和G18）进行了PCR检测,经过克隆、测序发现这些样品均感染了双生病毒。对所得到的部分病毒基因组序列进行联配比较后发现它们具有96.6%到98.5%的序列同源性,表明它们感染了同一个双生病毒。因此对其中的G16和G18分离物进行了病毒全基因组序列测定,发现G16和G18的全长分别为2729个核苷酸（AJ704602）和2733个核苷酸（AJ558119）,它们之间的序列同源性达到98.7%。与其它已报道的双生病毒进行比较发现,G16和G18与越南番茄曲叶病毒的相似性最高,分别为83.6%和82.8%。根据双生病毒“种”的分类标准,G16和G18代表同一个双生病毒新种的不同分离物,因此我们将这个双生病毒新种命名为中国番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Chinavirus,ToLCCNV）。系统进化及重组分析发现ToLCCNV可能是一个由重组产生的新病毒。进一步通过PCR的方法发现这些分离物中都含有卫星DNAβ,并对其全序列也进行了测定。序列测定表明与G16、G17和G18三个分离物伴随的DNAβ的全长分别为1346个核苷酸、1341个核苷酸和1342个核苷酸（AJ704610-AJ704612）。与其它已报道的卫星DNAβ的序列比较发现这三个DNAβ分子都与中国番茄黄化曲叶病毒Y8分离物的DNAβ具有最高的同源性,分别达到49.1%、49.1%和49.8%。同时,为了研究卫星DNAβ的致病性及生物学功能,构建了ToLCCNV-G18及其伴随的卫星DNAβ的侵染性克隆,致病性测定发现卫星DNAβ是ToLCCNV诱导产生典型的病害症状所必需的,同时其还能提高ToLCCNV在寄主植物中的积累量。利用农杆菌共浸润等方法发现ToLCCNV DNAβ编码的βC1蛋白为RNA沉默抑制子。同时为了明确βC1蛋白中维持RNA沉默抑制子功能的关键氨基酸基序,根据生物信息学预测的结果构建了7个不同区段缺失的βC1突变体。农杆菌共浸润试验、Northern及Western印迹杂交结果表明βC1蛋白的44-74位氨基酸构成的中心结构域（central domain）对于维持βC1抑制子活性是至关重要的。由于目前已报道的大多数RNA沉默抑制子也是致病因子,所以又构建了7个βC1不同区段缺失的DNAβ的突变体的侵染性克隆。侵染性测定发现所有的突变体都可以在ToLCCNV的辅助下系统侵染本氏烟,但是均不能诱导产生明显的症状,表明βC1蛋白的任何一段氨基酸序列都是其诱导产生典型病害症状所必需的。Southern印迹杂交分析发现虽然所有的突变体都能够在本氏烟中复制并且各个突变体之间的复制水平以及对辅助病毒的影响不尽相同,但是总体来说它们的复制水平远远低于野生型DNAβ的复制水平。以上实验结果表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性并不是其诱导产生病害症状的决定因素。为了确定βC1蛋白及其突变体的亚细胞定位,利用激光共聚焦显微镜对βC1及其突变体与GFP的融合蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位进行了研究。结果发现不具备RNA沉默抑制子活性的突变体βC1dm44-60和βC1dm61-74也不能在细胞核中定位,而野生型及其它突变体βC1则均能在细胞核和细胞质中定位,表明βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性与其能否在细胞核中定位有关,其44-74位氨基酸构成的中心结构域对于维持βC1蛋白的RNA沉默抑制子活性和在细胞核中的定位都是必需的。从ToLCCNV单独接种或与其卫星DNAβ共同接种的本氏烟中克隆到了11个病毒或卫星DNAβ来源的小RNA。进一步的分析发现这些来源于病毒的小RNA主要集中在CP的转录区和βC1的转录区,表明病毒可能具有产生小RNA的热点区。3.泰国番茄黄化曲叶病毒是一个伴随有卫星DNAβ的单组份双生病毒泰国番茄黄化曲叶病毒（TYLCTHV）引起的番茄黄化曲叶病是影响泰国番茄生产最重要的病害之一,为了明确该病毒到底是单组份双生病毒还是双组份双生病毒,构建了TYLCTHV-Y72分离物及其伴随的卫星DNAβ的侵染性克隆。致病性测定表明TYLCTHV可以单独侵染本氏烟、心叶烟和番茄并诱导产生典型的症状,但是当与其卫星DNAβ共同接种时则能够加重病害症状,并且可以提高病毒在植物组织中的积累量。根据以上实验结果以及之前的相关报道,我们认为TYLCTHV是一个伴随有卫星DNAβ的单组份双生病毒。4.广西番茄曲叶病是由两种双生病毒及卫星DNA复合侵染引起的通过PCR、Southern印迹、RCA-PCR以及测序等方法对采自广西省表现出曲叶症状的31个番茄样品进行了复合侵染检测,发现双生病毒的复合侵染是导致广西省番茄曲叶病的重要原因。所有检测的样品中均含有ToLCCNV和中国番木瓜曲叶病毒（PaLCCNV）两种病毒,同时还伴随有ToLCCNV DNAβ或者TYLCCNV DNAβ。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 第一节 双生病毒的分类和基因组组成
• 1.1 双生病毒属的划分及基因组结构
• 1.1.1 玉米线条病毒属（Mastrevirus）
• 1.1.2 甜菜曲顶病毒属（Curtovirus）
• 1.1.3 番茄伪曲顶病毒属（Topocuvirus）
• 1.1.4 菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）
• 1.2 双生病毒种的划分
• 1.2.1 Mastrevirus种水平的划分标准
• 1.2.2 Curtovirus种水平的划分标准
• 1.2.3 Topocuvirus种水平的划分标准
• 1.2.4 Begomovirus种水平的划分标准
• 1.3 双生病毒种下水平的分类标准
• 1.3.1 病毒种下水平的几个概念
• 1.3.2 双生病毒株系和变种的划分
• 1.4 双生病毒的命名
• 1.5 与双生病毒伴随的卫星DNAβ的分类研究进展
• 1.5.1 与双生病毒伴随的卫星DNAβ种的分类标准
• 1.5.2 与双生病毒伴随的卫星DNAβ的命名
• 1.6 存在问题与展望
• 第二节 双生病毒的进化与变异
• 2.1 双生病毒遗传变异的源泉
• 2.1.1 突变
• 2.1.2 假重组
• 2.1.3 重组
• 2.2 双生病毒的复合侵染
• 2.3 双生病毒及其伴随的小分子DNA的进化
• 2.4 存在问题与展望
• 第三节 双生病毒与RNA沉默
• 3.1 植物中RNA沉默途径的多样性
• 3.2 双生病毒既是RNA沉默的激发子又是其靶标分子
• 3.3 双生病毒编码的RNA沉默抑制子
• 3.3.1 双组份Begomoviruses编码的沉默抑制子
• 3.3.2 单组份Begomoviruses编码的沉默抑制子
• 3.3.3 伴随有卫星DNAβ的单组份Begomoviruses编码的沉默抑制子
• 3.3.4 Curtoviruses编码的沉默抑制子
• 3.4 存在问题与展望
• 第二章 与赛葵黄脉病毒相伴随的卫星DNAβ的变异及其致病性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源和植物总DNA的提取
• 1.2 田间样品的PCR检测
• 1.3 序列变异和系统进化分析
• 1.4 MYVV和DNAβ的侵染性克隆构建
• 1.5 农杆菌介导的植物接种
• 1.6 粉虱传毒实验
• 1.7 病毒的Southern印迹检测
• 2 结果与分析
• 2.1 MYVV田间分离物均伴随有DNAβ
• 2.2 MYVV DNAβ分子的群体遗传变异
• 2.3 MYVV和MYVV DNAβ的致病性和寄主范围测定
• 2.4 MYVV与异源DNAβ的互作
• 3 讨论
• 第三章 中国番茄曲叶病毒及其卫星DNA的致病性研究
• 第一节 中国番茄曲叶病毒是一个伴随有卫星DNAβ的双生病毒新种
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源和植物总DNA的提取
• 1.2 田间样品的TAS-ELISA和PCR检测
• 1.3 病毒全长基因组的克隆和序列测定
• 1.4 DNA-B组份的寻找方法
• 1.5 DNAβ全长基因组的克隆和序列测定
• 1.6 病毒基因组序列分析和重组检测
• 1.7 ToLCCNV和DNAβ的侵染性克隆构建
• 1.8 农杆菌介导的植物接种
• 1.9 病毒的Southern印迹检测
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒分离物的抗原表位谱分析
• 2.2 病毒基因组结构与序列分析
• 2.2.1 ToLCCNV与其它双生病毒的分子进化分析
• 2.2.2 ToLCCNV DNAβ与其它DNAβ的分子进化分析
• 2.2.3 ToLCCNV是一个重组病毒
• 2.3 ToLCCNV和ToLCCNV DNAβ的致病性和寄主范围测定
• 2.4 ToLCCNV与异源DNAβ的互作
• 3 讨论
• 第二节 中国番茄曲叶病毒卫星DNA的βC1蛋白的结构与功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 质粒和菌株
• 1.1.3 抗体
• 1.2 βC1蛋白的生物信息学分析
• 1.3 Overlap-PCR
• 1.4 载体构建
• 1.5 农杆菌浸润接种
• 1.6 GFP荧光观察和拍照
• 1.7 RNA的提取及Northern印迹分析
• 1.8 SDS-PAGE电泳和Western印迹分析
• 1.9 农杆菌介导的植物接种
• 1.10 病毒的Southern印迹检测
• 1.11 野生型βC1和突变体βC1的亚细胞定位
• 1.12 激光共聚焦显微镜观察
• 2 结果与分析
• 2.1 ToLCCNV DNAβ编码的βC1蛋白为RNA沉默的弱抑制子
• 2.2 维持βC1蛋白的RNA沉默抑制子功能的关键氨基酸区域
• 2.3 βC1蛋白缺失突变体的侵染性和致病性
• 2.4 ToLCCNV DNAβ编码的βC1蛋白及其突变体在烟草表皮细胞中的定位
• 3 讨论
• 第三节 中国番茄曲叶病毒及其卫星DNA侵染组织中small RNA的克隆和鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 RNA的提取及分离低分子量的RNA
• 1.2.1 器皿和容器的处理
• 1.2.2 植物总RNA的提取
• 1.2.3 低分子量RNA的分离
• 1.3 割胶回收低分子量的RNA
• 1.4 3′-接头连接
• 1.5 5′-接头连接
• 1.6 回收连接产物
• 1.7 RT-PCR扩增small RNA
• 1.8 将PCR产物连入Invitrogen的PCR（?）2.1-TOPO载体并导入大肠杆菌TOP 10F′
• 1.9 菌落PCR筛选插入片段
• 1.10 Northern印迹杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 small RNA的直接克隆及其大小分布
• 2.2 来源于病毒的small RNA的二级结构分析及其在病毒基因组上的分布
• 3 讨论
• 第四章 泰国番茄黄化曲叶病毒-Y72分离物是一个伴随有卫星DNAβ的单组份双生病毒
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源和植物总DNA的提取
• 1.2 DNA-B组份的检测
• 1.3 TYLCTHV-Y72的侵染性克隆的构建
• 1.4 TYLCTHV-Y72 DNAβ的侵染性克隆的构建
• 1.5 农杆菌介导的植物接种
• 1.6 病毒的Southern印迹检测
• 2 结果与分析
• 2.1 TYLCTHV-Y72不含有DNA-B组份
• 2.2 TYLCTHV-Y72单独侵染可以诱导产生严重症状
• 2.3 TYLCTHV的卫星DNAβ可以提高TYLCTHV的核酸积累水平
• 3 讨论
• 第五章 广西省番茄曲叶病田间复合侵染调查
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源和植物总DNA的提取
• 1.2 田间样品的PCR检测
• 1.3 田间样品的病毒卫星的Southern印迹检测
• 1.4 田间样品的RCA-PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR检测病毒复合侵染
• 2.2 卫星DNAβ复合侵染检测
• 3 讨论
• 全文总结
• 附录A 本论文所用缩写词及中英文对照
• 附录B 本论文所用病毒缩写及中英文对照
• 附录C 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 附录D 本论文常用试剂及缓冲液的配制
• 作者简介