农杆菌介导犁苞滨藜NHX基因转化苜蓿影响因素的研究

论文摘要

本试验以子叶为外植体研究了2个苜蓿品种（新牧1号杂花苜蓿、新疆大叶紫花苜蓿）的组织培养程序,建立了苜蓿子叶植株再生体系。利用农杆菌介导法,将耐盐基因犁苞滨藜NHX转入苜蓿中,初步优化了农杆菌转化的方法。研究结果如下:（1）苜蓿子叶高效再生体系的建立①诱导培养基:MS+2,4-D 2mg/L +KT 0.5mg/L,新牧1号杂花苜蓿的出愈率为98.3%,新疆大叶紫花苜蓿的出愈率为97.5%;②分化培养基:MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L;新牧1号杂花苜蓿的绿芽分化率为38.4%,成苗率为19.3%;新疆大叶紫花苜蓿的绿芽分化率为43.3%,成苗率为22.5%;③生根培养基:1/2MS,新牧1号杂花苜蓿的生根率为45.7%,移栽成活率为78.3%,新疆大叶紫花苜蓿的生根率为62.6%,移栽成活率为74.2%。（2）农杆菌介导犁苞滨藜NHX的苜蓿遗传转化体系在愈伤组织诱导阶段加入卡那霉素对愈伤组织的再生有抑制作用,延迟15天进行抗性愈伤组织的筛选,可提高转化效率。本文以浸染后外植体的抗性愈伤组织率和抗性体胚形成率为指标建立了转化体系:子叶为转化受体的菌液浓度为OD600=0.4～0.5,浸染时间为10～15min,预培养3d,共培养4d,AS浓度为20～30mg/L;使用200mg/L的羧苄青霉素脱菌,在Kan 50mg/L下筛选得到具有卡那抗性的子叶愈伤组织系,在Kan 10mg/L下筛选出抗性芽;对所获得的抗性芽进行PCR检测,结果表明犁苞滨藜NHX基因整合到了苜蓿基因组中。

论文目录

• 英文缩略语
• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 1 植物耐盐的生理生化机制与植物耐盐基因工程
• 1.1 盐胁迫对植物的伤害
• 1.2 植物的盐胁迫适应机制
• +/H⁺逆向转运蛋白的研究进展'>2 NA⁺/H⁺逆向转运蛋白的研究进展
• +/H⁺逆向转运蛋白基因的发现'>2.1 NA⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的发现
• +/H⁺逆向转运蛋白的分子结构'>2.2 NA⁺/H⁺逆向转运蛋白的分子结构
• +/H⁺逆向转运蛋白基因与耐盐性的关系'>2.3 NA⁺/H⁺逆向转运蛋白基因与耐盐性的关系
• 3 遗传转化方法及应用
• 3.1 农杆菌介导法
• 3.2 基因枪转化法
• 3.3 电击法
• 4 苜蓿遗传转化的研究进展
• 4.1 转苜蓿品质改良基因的研究
• 4.2 转抗逆基因苜蓿的研究
• 4.3 转抗病毒基因苜蓿的研究
• 4.4 转抗虫基因苜蓿的研究
• 4.5 转抗除草剂基因苜蓿的研究
• 4.6 转基因苜蓿生产可食疫苗的研究
• 第二部分 试验及结果
• 第一章 苜蓿高效再生体系建立的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 统计标准
• 2 结果与分析
• 2.1 不同浓度2,4-D 对子叶愈伤组织诱导的影响
• 2.2 不同KT、6-BA 浓度对子叶愈伤组织诱导的影响
• 2.3 不同浓度6-BA 对芽分化的影响
• 2.4 生根及移栽
• 3 结论
• 4 讨论
• 第二章 农杆菌介导的犁苞滨藜NHX 基因转化体系的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 转化效率统计标准
• 1.4 数据统计
• 1.5 抗生素种类及浓度的确定
• 1.6 影响转化效果因子的研究
• 1.7 转基因愈伤组织的分子检测
• 2 结果与分析
• 2.1 选择培养中抑菌剂及其浓度的确定
• 2.2 选择培养中卡那霉素选择压的确定
• 2.3 转化体系的优化
• 2.4 抗性绿芽的PCR 检测
• 3 结论
• 4 讨论
• 4.1 外植体对转化效率的影响
• 4.2 AS 对转化效率的影响
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢
• 作者简介