论文摘要
目的视神经（optic nerve,ON）的损伤是许多视网膜和视神经疾病发展到最后导致视力下降甚至丧失的常见原因,目前临床上没有有效的治疗方法。ON由视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）的轴突组成,RGCs的进行性死亡是ON损伤时导致视功能不可逆性损害的主要原因。如何能够促进和诱发损伤的RGCs修复和再生,从而使ON功能恢复是目前研究的热点。但是目前在临床上,对ON损伤后RGCs存活与轴突再生的治疗还没有既安全又有效、能够推广应用的方法。重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin,rhEPO）是一种在临床上已经广泛应用的药物,从目前的研究结果看,可以肯定其有神经保护作用。ON作为中枢神经系统的一部分,在其发生损伤时,也可能有rhEPO的神经保护作用参与。然而目前关于rhEPO在ON损伤性疾病中保护RGCs作用的研究报道很少,确切的机制也不明确。为明确rhEPO是否能在离体及活体时均能促进RGCs存活和再生,进而促进视神经功能修复,我们拟观察rhEPO对体外培养的大鼠RGCs存活及其轴突生长的影响,检测作为神经再生标志的生长相关蛋白43（Growth associated protein 43,GAP—43）的表达情况;为模拟临床上大多数ON损伤性疾病时其不完全性损伤的状态,我们制作大鼠ON夹伤模型,以使神经损伤的状态更接近于临床的疾病状态,并采取rhEPOH艮局部给药的方式（玻璃体腔注射）,以避免rhEPO全身应用的副作用,来检测rhEPO对ON损伤后在体RGCs存活和再生的影响;并通过观察大鼠F-VEP的变化,来检测rhEPO在ON损伤后促进神经功能修复的作用:同时探讨rhEPO的最佳应用剂量,以期为治疗视神经损伤性疾病探索一种安全有效的方法。方法1、RGCs体外培养,分为实验组（rhEPO组）和对照组（DMEM组）,倒置显微镜下观察细胞和轴突生长情况,测量细胞最长突起长度进行比较。行GAP-43的Western blot检测,图像分析系统对两组标本进行灰度值测量。结果行t检验。2、制作大鼠ON夹伤模型,分为治疗组（rhEPO组）和对照组（生理盐水组）。其中治疗组按治疗剂量不同分为5U-rhEPO组、15U-rhEPO组和50U-rhEPO组。不同剂量治疗组和对照组又按夹伤后处死的时间点不同,分为伤后1w、2w、4w三个时间点。模型制作完成当时立即使用微量进样器向术眼玻璃体腔内进行注射,不同剂量治疗组分别注入5U、15U、50U的rhEPO,对照组则注入5μ1生理盐水。3、分别于伤后1w、2w、4w三个时间点处死大鼠摘除眼球,制作5μm视网膜切片,行Thy1.1和GAP-43免疫组化染色。每张切片分别随机选取5个镜下视野框（400×）,采集镜下图像,应用图像分析系统对结果进行分析。计数Thy1.1染色阳性细胞数,测量GAP—43阳性表达的平均灰度值,结果行方差分析。4、利用大鼠ON夹伤模型,不同组分别于ON损伤前、损伤后即时、伤后1w、伤后2w、伤后4w进行F-VEP检查,测量P1波峰潜时和振幅进行比较,结果行方差分析。结果1、培养3d的RGCs倒置显微镜下观察,形成典型的细胞突起,rhEPO组的细胞比对照组胞体更大,突起更长（P＜0.05）。2、培养3d的RGCs行GAP-43 Western blot检测,DMEM组GAP-43呈阳性表达,rhEPO组呈强阳性表达,两组差异有统计学意义（P＜0.05）。3、在大鼠ON夹伤模型中,ON损伤后RGCs数量随时间推移而递减。在每个时间点,不同剂量rhEPO治疗组的RGCs数量均多于对照组（P＜0.05）,15U-rhEPO组和50U-rhEPO组的RGCs数量均多于5U-rhEPO组（P＜0.05）,而15U-rhEPO组和50U-rhEPO组之问比较没有明显差异（P＞0.05）。4、GAP-43的免疫组化染色:正常大鼠视网膜上未检测到GAP-43的阳性表达。在大鼠ON损伤后1w时视网膜上出现GAP-43较强的阳性表达,主要存在于神经节细胞层;2w时表达水平下降;4w时阳性表达基本消失。在不同剂量的rhEPO治疗组中,大鼠ON损伤后1w和2w的视网膜上GAP-43均呈现强阳性表达,并且阳性表达主要存在于神经节细胞层;4w时表达水平下降。不同剂量rhEPO治疗组在伤后不同时间点的视网膜中,GAP-43的阳性表达均高于同一时间点的对照组（P＜0.05）;15U-rhEPO组和50U-rhEPO组的表达水平高于同一时间点的5U-rhEPO组（P＜0.05）,而前二者比较没有明显差异（P＞0.05）。5、F-VEP检测:正常Wistar大鼠F-VEP呈现典型的NPN波形,P1波峰潜时短,波峰陡直。ON损伤后立即检测F-VEP即出现明显变化,P1波峰潜时明显延长,波峰显著降低。伤后4w时对照组P1波峰潜时缩短,波峰略回升。伤后2w开始三个治疗组P1波峰潜时较伤后即时和伤后1w明显缩短,振幅增加,与同一时间点的对照组相比有明显好转（P＜0.05）。其中15U-rhEPO组和50U—rhEPO组最为明显,均好于5U-rhEPO组（P＜0.05）。结论1、rhEPO能够促进体外培养的RGCs的轴突生长;2、rhEPO能够上调体外培养的RGCs的GAP-43蛋白表达水平,可能是其能够促进RGCs轴突生长的原因;3、ON损伤后rhEPO能促进RGCs存活;4、ON损伤后rhEPO能延长GAP-43表达的时间、增加其表达的强度,从而促进RGCs的存活和再生;5、rhEPO能够促进损伤的ON F-VEP恢复;6、采用玻璃体腔注射的方式给药,5U的rhEPO即能引起细胞水平的变化,但对视功能的影响不明显,在一定范围内随rhEPO剂量的增加视神经保护作用加强。
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标签：重组人促红细胞生成素论文; 视神经损伤论文; 视网膜神经节细胞论文; 生长相关蛋白论文; 神经保护论文;