精氨酸修饰的壳聚糖非病毒基因载体的研究

论文摘要

壳聚糖是一种天然的阳离子多糖,具有良好的生物相容性,生物降解性,低免疫原性以及无毒性的优点。壳聚糖通过静电作用可以与DNA形成聚电解质复合物,保护DNA免受核酸酶的降解,从而促使DNA顺利的进入细胞,因此壳聚糖作为非病毒基因载体具有广泛的应用前景。本文制备了一种新型的精氨酸修饰的壳聚糖（Arg-CS）非病毒基因载体,研究内容主要包括以下两个方面: 1、精氨酸修饰的壳聚糖的制备及其与DNA复合物的表征。以碳二亚胺为偶联剂,将精氨酸偶联到壳聚糖上制备了精氨酸修饰的壳聚糖缀合物,并通过复凝聚的方法,制备了纳米尺寸的Arg-CS/DNA聚电解质复合物。通过红外光谱和核磁共振图谱分析,可以确认精氨酸已经共价连接到壳聚糖上。圆二色谱结果表明DNA与壳聚糖作用形成纳米尺寸的复合物后仍然保持着典型的B型构象。用透射电镜,原子力显微镜和光子相关光谱检测复合物的表面形态和尺寸大小分布,结果表明,精氨酸修饰的壳聚糖/DNA纳米复合物（N/P=2:1）呈现不规则的球形,复合物的直径分布大多在80～150nm之间,有利于基因转染。2、细胞系和组织块法培养血管平滑肌细胞,并以血管平滑肌细胞为宿主细胞,初步探讨以精氨酸修饰的壳聚糖为载体,介导编码绿色荧光蛋白质粒转染的可行性。倒置荧光显微镜下观察到明亮清晰的绿色荧光,并且呈现出明显的平滑肌细胞形态,说明编码绿色荧光蛋白的质粒DNA被精氨酸修饰的壳聚糖载体成功地导入血管平滑肌细胞,并得到有效的表达。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 基因治疗的概念
• 1.1.2 基因治疗的历史回顾及我国的研究现状
• 1.1.3 基因治疗的途径
• 1.1.4 基因治疗的策略
• 1.1.5 基因治疗的步骤
• 1.1.6 基因治疗中有待解决的关键问题
• 1.1.7 理想载体的特征
• 1.2 非病毒载体
• 1.2.1 裸DNA
• 1.2.2 脂质体
• 1.2.3 聚合物
• 1.2.3.1 聚L-赖氨酸
• 1.2.3.2 聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）
• 1.2.3.3 树状聚合物
• 1.2.3.4 明胶
• 1.2.4 其它聚合物
• 1.2.5 复合载体
• 1.2.5.1 脂质复合物
• 1.2.5.2 拟病毒颗粒
• 1.2.6 基于抗体的靶向基因传递系统
• 1.3 壳聚糖非病毒载体
• 1.4 论文工作的提出
• 第二章 精氨酸修饰的壳聚糖/DNA 复合物的制备及表征
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 原料与仪器
• 2.2.1.1 原料
• 2.2.1.2 仪器
• 2.2.2 精氨酸修饰的壳聚糖缀合物的制备
• 2.2.3 精氨酸修饰的壳聚糖/DNA 纳米复合物的制备
• 2.2.4 材料的表征
• 2.2.4.1 红外光谱分析（FTIR）
• 13C 核磁共振分析（NMR）'>2.2.4.2¹³C 核磁共振分析（NMR）
• 2.2.4.3 凝胶电泳阻滞实验（Gel Retardation Assay）
• 2.2.4.4 光子相关光谱分析（PCS）
• 2.2.4.5 透射电镜观察（TEM）
• 2.2.4.6 原子力显微镜观察（AFM）
• 2.2.4.7 圆二色谱分析（CD）
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 红外光谱分析
• 13C 核磁共振分析'>2.3.2¹³C 核磁共振分析
• 2.3.3 凝胶电泳阻滞实验分析
• 2.3.4 光子相关光谱分析
• 2.3.5 透射电镜观察
• 2.3.6 原子力显微镜观察
• 2.3.7 圆二色谱分析
• 2.4 结论
• 第三章 精氨酸修饰的壳聚糖介导基因转染的初步研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 原料与仪器
• 3.2.1.1 原料
• 3.2.1.2 仪器
• 3.2.2 质粒的图谱
• 3.2.3 质粒DNA 的提取
• 3.2.3.1 质粒DNA 的小量提取
• 3.2.3.2 质粒DNA 的大量提取
• 3.2.4 平滑肌细胞的培养
• 3.2.4.1 培养液的准备
• 3.2.4.2 血管平滑肌原代细胞的组织块培养
• 3.2.4.3 血管平滑肌细胞的培养
• 3.2.5 Lipofectamine 试剂介导pIRES2-EGFP 质粒体外转染平滑肌细胞
• 3.2.6 精氨酸修饰的壳聚糖介导pIRES2-EGFP 质粒体外转染平滑肌细胞
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Lipofectamine 试剂介导pIRES2-EGFP 质粒体外转染平滑肌细胞
• 3.3.2 精氨酸修饰的壳聚糖介导pIRES2-EGFP 质粒体外转染平滑肌细胞
• 3.4 结论
• 全文主要结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间完成的论文
• 致谢