论文题目: 鉴定不同基因组之间差异序列的新方法研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物医学工程
作者: 曹月青
导师: 夏玉先
关键词: 基因组差异,差减杂交,杂交监控,保守序列
文献来源: 重庆大学
发表年度: 2005
论文摘要: 鉴别不同生物基因组的差异及其序列信息,有助于揭开物种间进化的规律,对于分子层面上的物种进化研究具有重要意义。对于近源物种,鉴定不同基因组之间差异序列,可以阐明与某些重要性状形成有关的基因,以及这些基因如何发挥作用。对于亲源关系较远的物种,差异序列可以作为构建进化树中的中间标记物种。如物种的全基因组测序完成后,可通过计算机进行数据库分析,直接找出物种间的差异。但对于基因组过于复杂的真核生物而言,目前难以对所有生物进行全基因组测序。近年来,出现了很多分离和鉴定物种之间差异序列的方法。这些方法大都是建立在差减杂交的基础上,基本原理是去除二者之间的共有序列,使差异序列得到富集。差减是否彻底是差减杂交能否成功的瓶颈,因此如何判断差减是否完成成为差减杂交最值得关注的问题。但现有的差异分析方法中,尚无有效的措施监控杂交过程,容易造成高假阳性。代表性差示分析(representative difference analysis,RDA)将“动力富集”引入PCR 为基础的差减杂交,但这种方法过于烦琐,操作不当容易产生高假阳性。同时由于差减后,差异片段与过量的driver DNA混杂在一起,使得PCR扩增差异片段时的模板DNA 的复杂度大大增加,大大降低了差异片段的扩增效率,导致覆盖率的降低,因此本方法通常用于两个差异极小的基因组或基因的差异表达。以抑制PCR 为基础的抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),被认为是目前分析基因组差异最有效的方法,已成功用于简单基因组差异分析和差异表达研究。但因没有合适的杂交对照,很难用于复杂基因组之间的差异分析,尽管Clontech公司生产的SSH试剂盒可以监控杂交过程,但因对照系统并不能真实反映样品的杂交条件,如DNA 样品的复杂度、浓度、质量。这些缺点使其很难判断杂交进程,容易造成假阳性。由于现有方法存在很大缺陷,对于差异多、基因组复杂的真核生物而言效果并不理想。本研究中,建立了一种分析复杂基因组之间差异序列的方法—杂交监控差异分析法(hybridization monitored differential analysis,HMDA)。在消减杂交的基础上引入了一种杂交监控体系,可以对整个杂交过程进行全过程监控。本方法是一种建立在PCR基础上的固相消减杂交,主要内容包括:待比较的两个基因组分别称为tester 和driver,将driver 固定在直径为6mm正电荷尼龙膜上,与液相中连接有接头的tester 杂交。通过与固定在杂交膜上的driver 杂交,可去除tester DNA 中的共有序列,差异序列逐渐被富集。每轮杂交结束后,更换新的固定有driver 的杂交膜。当在tester 中,PCR 检测不到共有序列时,杂交结
论文目录:
中文摘要
英文摘要
缩略词
1 绪论
1.1 研究意义与背景
1.2 基因组差异分析方法的种类
1.3 用于DNA 分子标记的基因组差异分析
1.3.1 限制性片段长度多态性(RFLP)
1.3.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)
1.3.3 扩增片段长度多态性(AFLP)
1.4 基于消减杂交的分离差异方法
1.4.1 消减杂交的原理
1.4.2 消减方式
1.4.3 常用的消减杂交方法
1.4.4 现有消减杂交方法的缺陷
1.5 差异序列的确定
1.5.1 Southern 杂交或点杂交
1.5.2 菌落杂交分析
1.5.3 核酸数据库比对分析
1.6 几种差异基因检测技术的比较
1.7 差异基因检测技术的应用
1.7.1 基因的分离
1.7.2 物种的鉴定和进化
1.7.3 分子标记
1.8 小结
1.9 研究目标和整体思路
1.9.1 研究目标
1.9.2 整体思路
1.10 研究内容与技术路线
1.10.1 研究内容
1.10.2 技术路线
1.11 本研究的创新性
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 菌株
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要溶液配制
2.1.4 主要仪器设备
2.2 主要方法
2.2.1 酵母基因组DNA提取(酶解法)
2.2.2 基因组DNA纯度及浓度测定
2.2.3 杂交监控体系的建立
2.2.4 接头制备
2.2.5 Tester DNA (酿酒酵母)的准备
2.2.6 Driver DNA(裂殖酵母)的处理
2.2.7 消减杂交过程分析
2.2.8 差异片段的克隆
2.2.9 测序结果分析
2.2.10 差异片断的富集效率
2.2.11 覆盖率统计分析
3 结果与分析
3.1 基因组DNA 的提取
3.2 杂交监控体系的建立
3.2.1 185 rDNA同源性分析
3.2.2 杂交监控序列的扩增
3.3 Tester 和driver DNA 的处理
3.3.1 Tester DNA(酿酒酵母)的酶切
3.3.2 分析tester DNA酶切片段与接头的连接效率
3.3.3 Driver DNA(裂殖酵母)的处理
3.3.4 Driver DNA 固定膜的选择及漂洗过程
3.3.5 Driver DNA 的固定效率
3.4 杂交过程分析
3.4.1 185 rDNA对消减过程的监控分析
3.4.2 杂交后tester DNA的扩增
3.5 数据分析及方法评价
3.5.1 差异片段的分析
3.5.2 差异片段的富集效率
3.5.3 覆盖率分析
4 讨论
4.1 本研究中实验材料的选择
4.2 杂交监控差异分析的特点及其与其他方法的比较
4.2.1 引入杂交监控体系
4.2.2 以PCR 为基础的差异分析
4.2.3 利用消减杂交的基本原理
4.2.4 发挥膜杂交的优势
4.3 杂交监控差异分析与其他方法的比较
4.3.1 Tester DNA的处理
4.3.2 Driver DNA的处理
4.3.3 消减过程
4.3.4 差异片段的扩增
4.3.5 差异分析的效率
4.3.6 适用范围
4.4 液相杂交和固相杂交在消减杂交中的优劣
4.4.1 液相消减杂交
4.4.2 固相消减杂交
4.5 185 rDNA 在其他生物基因组DNA 差异分析中的应用
4.6 185 rDNA 监控分析对不同拷贝 DNA 序列差异分析的影响
4.7 影响杂交监控差异分析阳性率的因素
4.7.1 相似区域大小
4.7.2 杂交的严谨性
4.7.3 相似性比较中E值设定
4.8 影响杂交监控差异分析覆盖率的因素
4.8.1 连接效率对覆盖率的影响
4.8.2 非特异性吸附对覆盖率的影响
4.8.3 PCR 扩增条件对覆盖率的影响
4.9 影响杂交监控差异分析富集效率的因素
4.9.1 评价差减效率的方法
4.9.2 影响差异富集效率的因素
5 结论
致谢
参考文献
附录1
附录2
发布时间: 2005-11-07
参考文献
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