与ATP6相互作用的蛋白质的筛选及基因的cDNA克隆

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植物细胞质雄性不育是一种不能产生有活力花粉的遗传性状，在高等植物中，是一种常见的生物学特征。甘蓝型油菜，是世界上广泛种植的一种油料作物，其杂交种能比亲本最高增产60％，因此把雄性不育应用于杂交种的生产具有重大的意义。目前，人们对于甘蓝型油菜雄性不育的研究主要集中于萝卜胞质不育，波里马胞质不育和nap胞质不育。波里马细胞质雄性不育因其不育性稳定，容易找到恢复基因，此不育系被认为在杂交中的生产中是最有优势的。研究表明，由于线粒体DNA的重排，在编码ATP合成酶第六亚基的基因(atp6的上游产生一个嵌合的具有224个密码子的开放阅读框（orf224），它与atp 6基因共转录，而这个atp6基因区域是与甘蓝型油菜pol CMS性状是相关的。酵母双杂交系统是近年来发展起来的一种有效的体内研究蛋白质之相互作用以及筛选cDNA文库的技术手段。为了深入研究与ATP6发生相互作用的，可能与油菜雄性不育有关的基因，我们采用了酵母双杂交系统进行蛋白质的筛选。将atp6基因和载体pGBKT7连接构建重组诱饵质粒pGBKT7／atp6。将双链cDNA和质粒pGADT7-Rec按照顺序转化的方法转化含有诱饵质粒pGBKT7／atp6的酵母AH109，通过营养缺陷型的选择和B－半乳糖苷酶（B-lacZ）活性检测进行筛选，初步获得酵母阳性克隆。提取阳性酵母的总DNA，进行PCR检测，并用限制性内切酶进行酶切，根掘PCR结果和酶切结果，剔除相同的片段，选择有代表性的酵母DNA转化E.coli JM109，涂布于LB+Amp培养基平板。并重新提取质粒pGADT7-Rec-cDNA，转化酵母AH109，验证是否与诱饵蛋白具有相互作用。最终获得5个阳性克隆，测序后，在NCBI上Blast比对分析结果表明，分别是在油菜生理过程中起着重要作用的基因：内质网膜上蛋白转运复合体a亚基（Sec61a），阳离子转运ATP酶复合体中的一个亚基，1，3-beta葡聚糖苷酶，水解酶以及光系统1L亚单位（PSAL）。根据筛选所获得的其中一个阳性克隆水解酶基因的序列，设计引物，通过cDNA末端快速扩增的方法扩增基因的未知序列。根据RACE扩增得到的序列，继续设计引物，通过热不对称交错PCR的方法扩增基因5’未知序列。根据三次的测序结果，拼接得到了基因的全长序列，设计全长引物：up-Primer：5’-TAGTITAGGGATGCTGTCCAAAAGTGT-3’，down Primer：5’-CAGAAGAATAACCAATCAAAAAACCATC-3’进行PCR扩增，得到了基因的全长cDNA序列。根据推导的氨基酸序列在NCBI上进行Blast比对分析，此蛋白质序列具有水解酶家族17的保守结构域，与拟南芥的beta-1,3-glucanase具有84％的同源性，可能为水解酶家族的一个成员。利用网站和多种生物学软件对推导出的氨基酸序列进行分析。分析结果表明，此氨基酸序列有以下特征：（1）有信号肽序列，前26个氨基酸序列可能是信号肽；（2）有两个跨膜结构域。设计引物up-Primer 5’-ATAGAATTC ATGCTGTCCAAAAGTGTTTTTNTGCTG-3’，down Primer：5’-CAGAAGAATAACCAATCAAAAAACCATC-3’，用Pfu酶进行PCR扩增后，用EcoRⅠ进行酶切，将此片段连接至经过EcoRⅠ和SmaⅠ酶切过的PSK载体。重组质粒通过XbaⅠ和EcoRⅤ进行双酶切，将片段克隆至经过XbaⅠ和Ecll36Ⅱ酶切过的pCAMBIA2301G载体，构建反向植物表达载体。

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前言

第一部分利用酵母双杂交系统筛选与油菜ATP6基因相互作用的蛋白质

1 材料及来源

1.1 菌株

1.2 载体

1.2.1 克隆载体

1.2.2 对照载体

1.3 生化试剂,酶制剂,试剂盒及仪器

1.4 培养基及试剂配方

2 实验方法

2.1 Carrier DNA的制备

2.2 酵母感受态细胞的制备

2.3 采用ds cDNA,pGADT7-Rec转化AH109

2.4 B-半乳糖昔酶（B-lacZ）活性检测

2.5 无效AD质粒的去除

2.6 酵母总DNA的提取

2.7 PCR检测

2.8 Taq Ⅰ,BsuR Ⅰ酶切,分组

2.9 重复鉴定

2.9.1 E.coli JM109感受态细胞的制备

2.9.2 酵母DNA转化E.coli JM109感受态细胞

2.9.3 阳性克隆的检测

2.9.4 小量提取pGADT7-Rec-cDNA质粒

2.9.5 pGADT7-Rec-cDNA质粒转回酵母

2.10 测序及比对分析

3 结果与分析

3.1 第一次筛选分析

3.2 PCR扩增检测插入片段

3.3 Taq Ⅰ,BsuR Ⅰ酶切,分组

3.4 酵母总DNA转化E.coli

3.5 相互作用的分析

3.6 测序及比对分析

4 小结与讨论

第二部分基因的克隆

1 材料及来源

1.1 实验材料

1.2 菌株

1.3 载体

1.4 主要试剂

1.5 试剂配方

2 实验方法

2.1 通过cDNA末端快速扩增的方法扩增5′端cDNA

2.1.1 油菜84100-18幼叶RNA的提取

2.1.2 cDNA第一链的合成

2.1.3 cDNA的纯化

2.1.4 cDNA末端加尾

2.1.5 第一轮PCR扩增

2.1.6 第二轮PCR扩增

2.1.7 PCR产物的回收

2.1.8 E.coli JM109感受态细胞的制备

2.1.9 回收片段连接pMD18-T载体

2.1.10 重组质粒的转化

2.1.11 阳性克隆的检测及测序

2.2 利用Tail PCR方法扩增5’端未知序列

2.2.1 油菜总DNA的提取

2.2.2 第一次Tail PCR扩增5’端未知序列

2.2.3 第二次Tail PCR扩增5’端未知序列

2.3 基因全长cDNA的克隆

2.3.1 基因扩增

2.3.2 片段的回收,连接,转化

2.3.3 阳性克隆的检测及测序

2.4 反向真核表达载体的构建

2.4.1 基因片段的扩增及酶切

2.4.2 pSK中间载体质粒的提取及酶切

2.4.3 pSK-目的基因中间载体的构建

2.4.4 pCAMBIA2301G-目的基因载体的构建

3 结果与分析

3.1 RACE的方法扩增5’端cDNA

3.2 第一次Tail PCR的方法扩增5’端序列

3.3 第二次Tail PCR的方法扩增5’端序列

3.4 基因全长的克隆

3.5 基因的cDNA序列全长及推导的蛋白质序列

3.6 蛋白质的序列分析和结构分析

3.6.1 一级结构的分析

3.6.2 蛋白质二级结构的分析

3.6.3 序列的同源比对分析

3.6.4 信号肽序列分析

3.6.5 亚细胞位点分析

3.6.6 跨膜区域的预测

3.6.7 蛋白质三级结构的预测

3.6.8 pSK目的基因质粒的酶切检测

3.6.9 pCAMBIA2301G-目的基因质粒的酶切检测

4 小结与讨论

文献综述

参考文献

致谢

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