青蒿反义鲨烯合酶基因转化培育青蒿素高产植株的研究

论文摘要

青蒿素是由我国科研人员自主研发并为国际所公认的一种抗疟有效单体。野生青蒿中青蒿素含量过低，难以满足疟疾治疗中对青蒿素的迫切需求。由于常规育种在青蒿素高产方面的作用有限，因此在青蒿素合成代谢途径已被阐明的情况下，通过基因工程对野生青蒿的青蒿素生产能力进行人工操纵不失为大幅度提高青蒿素含量的最佳选择。已有证据表明，当植株接触真菌刺激物时，其鲨烯合酶基因（SS）表达下调，从而导致类固醇积累减少，同时倍半萜合成增加，暗示类固醇合成阻遏可能导致倍半萜合成途径活化。为了培育青蒿素高产的转基因青蒿植株，我们用Ti质粒衍生的双元载体上携带反义SS基因的工程农杆菌对青蒿外植体进行遗传转化。本文描述了转反义SS基因后内源SS基因的抑制及其后果：在所获得的3棵转基因植株中，通过Southern印迹杂交已对反义SS基因整合的拷贝数进行计数（1个至多个拷贝）。半定量RT-PCR分析结果显示，反义SS基因的功能表达已导致内源SS基因表达下调，使SS mRNA水平下降，类固醇含量也从0.8mg／g鲜重降低到0.4-0.5mg／g鲜重，降幅达50％。转基因青蒿植株青蒿素含量（12.3mg／g干重）远比非转基因青蒿植株青蒿素含量（4.5mg／g干重）为高。为了进一步将碳流引向青蒿素，我们对转基因植株进行了短暂的冷胁迫处理（4℃，30min），结果使青蒿素含量进一步提高，其中最高者达到16.6mg／g干重。因此，采取类固醇合成阻遏与冷诱导青蒿素合成基因高效表达的联合策略可以显著促进青蒿素的高产，可望最终培育出转基因高产青蒿素新品系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 反义RNA及其功能
• 1.1 反义RNA对基因表达的调控
• 1.1.1 反义RNA作用于原核基因
• 1.1.1.1 复制水平的调控
• 1.1.1.2 转录水平的调控
• 1.1.1.3 翻译水平的调控
• 1.1.2 反义RNA作用于真核基因
• 1.1.2.1 影响mRNA前体的剪接
• 1.1.2.2 影响mRNA的转移
• 1.1.2.3 影响mRNA的修饰
• 1.2 反义RNA在植物基因表达调控中的应用
• 1.2.1 抵御病毒感染
• 1.2.1.1 抗RNA病毒
• 1.2.1.2 抗DNA病毒
• 1.2.2 抑制果实成熟
• 1.2.3 改变花色
• 1.2.4 降低直链淀粉含量
• 1.2.5 提高硬脂酸含量
• 1.2.6 控制雄性不育
• 1.2.7 阻断特殊合成途径
• 1.2.8 其他方面的应用
• 2 植物类异戊二烯合成及其生物学意义
• 2.1 异戊二烯合成途径的亚细胞定位
• 2.1.1 细胞质MVA途径
• 2.1.2 质体非MVA途径
• 2.2 类异戊二烯合成关键酶及其编码基因
• 2.2.1 HMG-CoA还原酶
• 2.2.2 鲨烯合酶
• 2.2.3 异戊二烯基转移酶
• 2.2.4 异戊烯焦磷酸合酶
• 2.2.5 萜烯合酶
• 3 青蒿素的生物合成途径
• 3.1 青蒿素合成的基本步骤
• 3.1.1 假定的非酶促反应
• 3.1.2 假定的酶促反应
• 3.2 青蒿素合成酶类及其编码基因
• 3.2.1 紫穗槐二烯合酶
• 3.2.2 细胞色素P450酶系
• 3.3 青蒿素合成基因表达及其调控
• 3.3.1 体外培养条件下青蒿素合成基因的表达
• 3.3.2 自然生长条件下青蒿素的积累规律
• 4 青蒿素的规模化生产及其现状
• 4.1 青蒿素原料的来源
• 4.1.1 青蒿素的非种植生产
• 4.1.2 青蒿素的种植生产
• 4.2 高产青蒿素的代谢途径工程育种
• 4.2.1 增大青蒿素合成的碳流
• 4.2.2 减少竞争性产物合成的碳流
• 5 本研究的立项依据
• 5.1 研究目的和意义
• 5.2 设计思路及研究对策
• 5.3 创新点及未来展望
• 第二章 青蒿SS基因克隆与序列分析
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种与质粒
• 1.3 试剂
• 1.4 仪器
• 2 方法
• 2.1 DNA提取
• 2.2 RNA提取
• 2.3 PCR扩增
• 2.4 RT-PCR扩增
• 2.5 质粒DNA提取
• 2.6 扩增片段回收与T-A克隆
• 2.7 大肠杆菌感受态细胞制备及转化
• 2.8 重组质粒鉴定
• 3 结果
• 3.1 青蒿SS DNA扩增
• 3.2 青蒿SS cDNA扩增
• 3.3 青蒿SS DNA克隆与鉴定
• 3.4 青蒿SS cDNA克隆与鉴定
• 3.5 青蒿SS基因的序列分析
• 4 讨论
• 第三章 反义基因载体构建与青蒿遗传转化
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种与质粒
• 1.3 抗生素和植物激素
• 1.4 试剂
• 1.5 仪器
• 2 方法
• 2.1 酶切、回收和连接
• 2.2 大肠杆菌转化与鉴定
• 2.3 农杆菌感受态细胞制备
• 2.4 农杆菌细胞转化与鉴定
• 2.5 植物叶盘转化
• 2.6 转基因植株再生
• 3 结果
• 3.1 反义SS基因表达载体构建
• 3.2 反义SS基因载体转化大肠杆菌鉴定
• 3.3 反义SS基因载体转化农杆菌鉴定
• 3.4 转反义SS基因青蒿细胞培养及植株再生
• 3.6 长期培养条件下转基因青蒿植株的表型观察
• 4 讨论
• 第四章 转基因青蒿植株分子鉴定及产物分析
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 2 方法
• 2.1 PCR检测
• 2.2 Southern杂交
• 2.3 半定量RT-PCR检测
• 2.4 类固醇含量测定
• 2.5 青蒿素含量测定
• 3 结果
• 3.1 反义SS序列导入青蒿细胞的证据
• 3.2 反义SS序列整合进青蒿基因组的证据
• 3.3 转基因青蒿中SS基因表达水平的检测
• 3.4 胆固醇标准曲线
• 3.5 反义SS基因表达对类固醇合成的影响
• 3.6 青蒿素标准曲线
• 3.7 SS基因表达阻遏对青蒿素合成的影响
• 3.8 冷胁迫促进转基因青蒿中青蒿素的积累
• 4 讨论
• 结语
• 参考文献
• 附录
• 致谢