IVF周期中最佳获卵数及双阴性T细胞在URSA中的作用研究

论文摘要

第一部分体外受精-胚胎移植周期中获卵数与妊娠结局之间的关系研究目的：已有的研究表明体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET）治疗周期中获卵数和IVF结局相关,但首次IVF周期获卵数和鲜胚及累积活产率之间的关系尚不清楚。本研究首次探讨获卵数对首次IVF周期活产率的影响。方法：回顾性分析2007年4月～2011年12月于安徽省立医院生殖中心行IVF-ET助孕治疗的不孕症患者2455例。患者年龄为18-34岁；所有患者月经周期正常；均以标准黄体期长方案促排卵行第一次IVF周期助孕；未进行种植前遗传学诊断或筛查；非供卵、部分供卵、接受供卵或解冻卵IVF周期；非自然周期或还有剩余冷冻胚胎冻存IVF周期。超促排卵、体外授精-胚胎移植、黄体支持、胚胎冻融及冻胚移植等按照我中心常规进行。单因素分析确定对活产率有影响的预测因子。按获卵数将患者分为5组：A组（<5个）,B组（6～10个）,C组（11～15个）,D组（≥16个）。比较各组受精率、可移植胚胎数、每起始周期鲜胚活产率、全胚冷冻率、每移植周期鲜胚活产率、每起始周期累积活产率、流产率及中重度卵巢过度刺激综合症（ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS）发生率。多变量Logistic回归排除了其他对活产率有影响的预测因子后分析获卵数对鲜胚活产率及累积活产率的影响。结果：2455个周期中1333个周期获得活产,活产率54.30%。获得活产的患者较未活产患者年轻（P=0.001）。获得活产的患者每日促性腺激素（gonadotropin, Gn）用量及Gn总用量小于未活产患者（P<0.001,P<0.05）；但是,获得活产患者的Gn使用天数明显长于未活产患者（P<0.001）。二者之间不孕年限、受精方式、不孕类型、助孕指征差异无显著性。获得活产患者获卵数、受精率、可移植胚胎数明显高于未活产患者（P<0.001,）；相反,获得活产患者平均移植鲜胚数量明显少于未活产患者（P<0.05）。各获卵数组之间的比较显示,年龄和获卵数呈负相关（P<0.001）。随获卵数的增加,受精率下降（P<0.001）,但可移植胚胎数却增加（P<0.001）。343个周期未移植新鲜胚胎,原因为：未获卵（9周期[0.37%]）,受精障碍（26周期[1.06%]）,无可移植胚胎（17周期[0.69%]）,因OHSS或其他原因行全胚冷冻（290周期[11.81%]）。随获卵数的增加,OHSS倾向取消鲜胚移植行全胚冷冻的患者增加（P<0.01）。每起始周期新鲜胚胎移植后活产率B、C两组显著高于A、D两组（P<0.01）,D组鲜胚活产率下降可能与OHSS倾向取消鲜胚移植行全胚冷冻的患者增多有关。而每移植周期的鲜胚活产率和每起始周期的累积活产率随获卵数的增加而增加（P<0.01,0.005）,分别从A组的38.69%和35.00%上升至D组49.07%和67.10%。同样,中重度OHSS的发生率随获卵数的增加而增加（P<0.01）,各组流产率相比差异无显著性（P>0.05）。多变量Logistic回归分析以A组作为参照组,结果表明,对于每起始周期新鲜胚胎活产率,当排除年龄、超促排卵天数、Gn用药总量、受精率的影响后,修正ORs从B组的1.823（1.395-2.381）升高至C组的2.142（1.609-2.851）。但是D组修正ORs下降,为1.918（1.376-2.672）。超促排卵天数、Gn用药总量、受精率与每起始周期鲜胚活产率相关,但是年龄与每起始周期鲜胚活产率相关性不显著。对于每起始周期累积活产率,当排除年龄、超促排卵天数、Gn用药总量、受精率的影响后,修正ORs在B组和D组分别为2.232（1.708-2.918）、5.805（4.125-8.170）,随获卵数增加而上升。超促排卵天数和受精率与累积活产率相关。结论：首次IVF周期中获卵数和鲜胚及累积活产率之间有很强的相关性。对年轻患者来说,卵巢高反应并不降低每起始周期IVF累积活产率,但是在IVF新鲜胚胎移植周期,卵巢高反应意味着因OHSS倾向取消鲜胚移植行全胚冷冻的患者增加。在首次IVF周期中,获得最佳活产率的获卵数是6-15个。第二部分TCRαβ+CD3+CD4-CD8-双阴性调节性T细胞在不明原因复发性流产中的作用及其机制研究目的：探讨TCRαβ+CD3+CD4-CD8-双阴性调节性T细胞（double negative regulatory T cells, DN Treg）在正常妊娠和不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA）患者外周血和母胎界面的含量和功能的变化,了解DN Treg细胞在URSA中的可能作用。同时检测URSA患者主动免疫治疗前后外周血DN Treg细胞水平变化,探讨主动免疫治疗的可能机制。研究结果有助于阐明DN Treg细胞在诱导母胎免疫耐受及URSA中的作用,以期为URSA的治疗寻找新靶点。方法：①采集正常非孕妇女、正常早孕妇女、URSA患者以及接受主动免疫治疗前后的URSA患者外周血,用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,分别检测各组DN Treg细胞含量的变化。②采集URSA患者或正常早孕行人工流产妇女蜕膜组织,分别检测各组中DN Treg细胞含量。③提取外周血单个核细胞、蜕膜局部白细胞,分离纯化DN Treg细胞。用抗CD3/CD28包被磁珠体外诱发活化DN Treg细胞。④采集各研究对象的外周血,分离淋巴细胞并制成悬液,CFSE染色后加或不加自体活化后的DN Treg细胞,同时加入抗CD3/CD28磁珠,共刺激培养5天后,上流式细胞仪检测,CELL Quest软件获取并分析,计算出增殖细胞的比例（CD4+或CD8+T细胞中CFSE dim细胞的比例）。结果：正常早孕妇女蜕膜组织中DN Treg细胞占CD3+T细胞的比例均明显高于外周血,分别为5.26%±3.58%和1.56±1.07%,差异有显著性（P<0.01）。同样,URSA患者蜕膜组织中DN Treg细胞比例也明显高于外周血,分别为1.82%±0.85%和0.92%±0.68%（P<0.01）。正常妊娠和正常非孕妇女外周血DNTreg细胞比例分别为：1.56%±1.07%和1.21%±0.63%,差异无统计学意义（P=0.217）；而URSA患者外周血中DN Treg细胞的比例显著低于正常妊娠妇女外周血,分别为0.92%±0.68%和1.56%±1.07%（P=0.009）。同样,URSA患者蜕膜组织DN Treg细胞也含量明显低于正常妊娠妇女蜕膜组织,差异有统计学意义（P=0.011）。体外功能测定显示：URSA患者的外周血和蜕膜组织中的DN Treg细胞可明显抑制自体CD4+和CD8-T细胞的增殖。同样,正常早孕者蜕膜组织DN Treg细胞也可抑制自体CD4+和CD8+T细胞的增殖。二组之间蜕膜组织DN Treg细胞的抑制能力无明显差异。接受免疫治疗共有54名患者,治疗后至今已分娩17例,目前妊娠已达21-35周有8例,12-20周7例,15例患者妊娠后再次流产,7例患者未孕。将妊娠>12周及分娩定为治疗成功计算,治疗成功率为59.2%。主动免疫治疗后,URSA患者外周血DN Treg细胞比例较治疗前上升,但差异无显著性（P=0.151）。但32例妊娠成功者主动免疫治疗后外周血DNTreg细胞比例较治疗前显著升高（P<0.05）,而15例妊娠失败者主动免疫治疗前后外周血DN Treg细胞比例无明显变化。结论：蜕膜是人DN Treg细胞在体内富集的部位之一。人DN Treg细胞在母胎免疫耐受中发挥重要的作用,外周血和蜕膜组织中]DN Treg细胞含量的减低可能与不明原因复发性流产的发生相关。通过提高URSA患者外周血中DN Treg细胞含量,可能是主动免疫治疗发挥作用的机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分 体外受精-胚胎移植周期中获卵数与妊娠结局之间的关系研究
• 前言
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• +CD3⁺CD4^-CD8^-双阴性T细胞在不明原因复发性流产中的作用及其机制研究'>第二部分 TCRαβ⁺CD3⁺CD4^-CD8^-双阴性T细胞在不明原因复发性流产中的作用及其机制研究
• 前言
• 第一章 DN Treg细胞在正常妊娠和URSA患者外周血和母胎界面的含量和功能的变化
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 结论
• 第二章 URSA患者主动免疫治疗前后外周血DN Treg细胞水平变化的研究
• 1.材料和方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况
• 攻读博士期间发表的论文