猪戊型肝炎病毒ORF2基因的原核表达及单克隆抗体的制备

论文摘要

戊型肝炎（Hepatitis E）是一种由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）引起的经消化道传播的人畜共患传染病。主要通过粪-口方式传播,在卫生条件较差的地方,水污染是暴发流行的主要原因,在亚洲、非洲和美洲等发展中国家呈现大规模爆发,发达国家主要以散发形式流行。该病在青少年中容易发展为暴发性肝炎,可以导致孕妇流产,病死率高达21%。HEV是一种线性单股正链、无囊膜的RNA病毒。病毒基因组由3个开放阅读框组成：ORF1、ORF2和ORF3,ORF1编码非结构蛋白,ORF2编码核衣壳结构蛋白,ORF3编码细胞骨架相关的磷蛋白。大量研究发现ORF2编码产生的核衣壳蛋白包含大量的抗原决定簇,靠近C端的2／3部分存在的大量优势B细胞表位,还有多个诱导产生中和抗体的抗原结合位点。ORF2编码的衣壳蛋白三个线性结构域,分别S结构域、P1结构域和P2结构域。HEV分布广泛,危害严重。HEV抗体广泛存在于非人灵长类、各种啮齿类以及猪鸡等家畜家禽中,并在人和猪等动物体内均检测到HEV核酸。因此,通过对猪源swCH189株HEV ORF2基因的分段原核表达,获得四个结构域的融合蛋白,不仅有助于了解S结构域蛋白的自我组装功能,P1结构域维持衣壳蛋白稳定性的机制,而且制备了5株针对P12蛋白的单克隆抗体,而且通过单克隆抗体的制备筛选P2结构域的抗原表位,可以为了解HEV衣壳蛋白组装机制,稳定机制和不同结构域的结构功能关系等提供实验基础,对于猪源HEV的诊断和建立一种特异性较高的ELISA诊断试剂盒等具有重要意义。本研究首先采用RT-PCR方法获得戊型肝炎病毒swCH189株ORF2全基因序列。根据ORF2蛋白线性结构域的分布和生物学软件预测结果设计四对引物,分别从构建的重组ORF2阳性质粒扩增S、P1、P2和P12四个基因片段,将得到的四个基因亚克隆到pET-32a（+）载体中,分别构建融合表达载体pET-S、pET-P1、pET-P1和pET-P12。重组表达载体分别转化合适的表达菌Rosetta（DE3）或者BL21（DE3）, IPTG诱导表达融合蛋白,菌体裂解产物经SDS-PAGE电泳分析结果,得到截短表达蛋白His-S、His-P1、His-P2和His-P12,大小分别为41kDa、35 kDa、45kDa和58 kDa,片段大小和预期分子量相符,主要以包涵体形式存在。采用Promege His标签蛋白纯化系统进行纯化后,得到高纯度的目的蛋白,可以直接用于免疫试验动物或者单抗的制备。纯化蛋白分组免疫兔子,可以获得高滴度的抗戊肝病毒结构蛋白多克隆抗体。免疫兔子血清作为一抗对表达蛋白进行Western blot鉴定其免疫原性结果说明：表达蛋白均与免疫兔子血清具有较强的反应原性。本实验采用纯化的融合蛋白His-P12免疫实验小鼠进行单克隆抗体的制备,细胞分泌上清进行间接ELISA和Western Blot检测。实验最终筛选出5株（1H3、3G11、4A7、3G12、4A2）为针对His-P12目的蛋白的杂交瘤细胞株,同时采用间接ELISA和Western blot检测细胞分泌上清的反应原性。结果说明,5株杂交瘤细胞株可以稳定分泌性质均一的单克隆抗体为筛选ORF2上的抗原表位和制备戊肝ELISA诊断试剂盒的研制提供相关的基础研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究现状
• 1.2.1 戊型肝炎病毒的流行病学
• 1.2.2 戊型肝炎病毒的理化特征
• 1.2.3 戊型肝炎病毒的基因型
• 1.2.4 戊型肝炎病毒的基因组
• 1.2.5 戊型肝炎病毒的细胞培养
• 1.2.6 致病性
• 1.2.7 戊型肝炎的临床症状和病理变化
• 1.2.8 戊型肝炎的检测
• 1.2.9 疫苗的研究
• 1.2.10 戊型肝炎病毒的抗原位点
• 第二章 戊型肝炎病毒ORF2基因的原核表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒血清
• 2.1.2 菌株载体与酶类
• 2.1.3 试剂与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 病毒总RNA提取
• 2.2.2 目的基因的表达
• 2.2.3 原核表达载体的构建
• 2.2.4 目的蛋白的诱导表达
• 2.2.5 工程菌的大量表达
• 2.2.6 重组蛋白的纯化
• 2.2.7 动物实验
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 HEVORF2序列抗原性,亲水性和信号肽的预测分析
• 2.3.2 目的基因的PCR扩增
• 2.3.3 重组克隆载体的PCR及酶切鉴定
• 2.3.4 序列测定与分析
• 2.3.5 重组表达质粒的酶切鉴定
• 2.3.6 目的片段的表达及检测
• 2.3.7 表达产物的纯化效果与蛋白浓度的测定
• 2.3.8 目的蛋白的Western-Blot鉴定
• 2.4 讨论
• 第三章 单克隆抗体的制备
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 细胞株、实验动物
• 3.1.2 试剂和仪器
• 3.1.3 免疫原的准备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 动物免疫
• 3.2.2 细胞准备及融合
• 3.2.3 杂交瘤细胞的筛选及鉴定
• 3.2.4 单克隆抗体腹水的制备及单抗的纯化
• 3.2.5 纯化单克隆抗体的酶联免疫吸附（EL!S）A及Wsetern一Blto检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 筛选方法中最佳杭原的包被浓度和最佳血清稀释度的确定
• 3.3.2 抗体的间接ELlsA方法检测效果
• 3.3.3 杂交瘤细胞株的建立
• 3.4 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介