胸腺五肽的固相合成及免疫学初步研究

论文摘要

以H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH为序列的胸腺五肽（TP5）是胸腺生成素II（Thymopoietin II）中第3236位的氨基酸残基片段,它保留了胸腺生成素II原有的生物活性,对机体的免疫系统具有双向调节作用,现已作为药物投放市场。本文研究固相法合成胸腺五肽,并对合成的多肽进行理化检测,研究其纯度及活性。合成方法采用Fmoc固相肽合成法,首先通过C18反相HPLC分析柱摸索纯化条件,然后以C18反相HPLC制备柱纯化。最后将制备的TP5样品旋转蒸发以除去残存的乙腈、三氟乙酸等,经冻干后制成白色粉末,以质谱仪测定其分子量,以反相HPLC分析其纯度,以E玫瑰花实验检测其生物活性。活性检测采用小鼠免疫抑制模型,分别测定了不同剂量TP-5对免疫抑制小鼠的脾指数、胸腺指数、巨噬细胞吞噬功能、体内T淋巴细胞转化功能、IL-2水平、血清溶血素含量等指标的影响;同时体外培养正常小鼠脾细胞,分别以不同浓度的TP-5处理,然后测定大鼠的脾指数、胸腺指数,观察脾脏和胸腺的病理组织学变化及T淋巴细胞亚群等指标的改变。本研究共合成三批胸腺五肽,纯化后制备成冻干粉末。精肽产量分别为27 mg,34 mg,32 mg。质谱检测证明合成TP-5分子量为679.8,与理论分子量相符。反相HPLC测定其纯度大于95%,表明该纯化方法有效。三批样品的玫瑰花结百分率均大于10%,证明合成的TP-5有生物活性。活性测定表明,浓度为0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、0.8 mg/kg的合成TP-5均可显著降低免疫抑制小鼠脾指数,显著增强免疫抑制小鼠的特异性和非特异性免疫功能,具有免疫原性。浓度为0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg的TP-5对正常大鼠的脾指数、胸腺指数、脾脏和胸腺的病理组织学及T淋巴细胞亚群（CD4/CD8）无明显影响,无免疫毒性。本课题的研究证明,用固相合成法可以成功地合成具有生物活性的TP-5,且有免疫调节功能,无免疫毒性,为以后实现产业化生产奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 胸腺五肽概述
• 1.2 胸腺五肽的作用及机理
• 1.2.1 胸腺五肽的免疫调节功能
• 1.2.2 胸腺五肽的药理作用
• 1.2.3 胸腺五肽的临床应用
• 1.2.4 胸腺五肽的安全性
• 1.3 胸腺五肽产品的现状及展望
• 1.4 肽的固相合成技术
• 1.4.1 多肽化学合成原理
• 1.4.2 多肽固相合成
• 1.4.2.1 Boc 固相法（经典 Merrifield 固相法）
• 1.4.2.2 Fmoc 固相法
• 1.4.3 Fmoc 固相合成法及其应用
• 1.4.3.1 固相载体
• 1.4.3.2 固相上的接肽反应
• 1.4.3.3 合成肽的纯化
• 1.4.3.4 合成肽纯度鉴定
• 1.5 研究目的与意义
• 第二章 胸腺五肽的固相合成
• 2.1 引言
• 2.2 肽合成用仪器与材料
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要材料
• 2.2.3 仪器和设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 主要试剂的配制
• 2.3.2 反应器预处理
• 2.3.3 固相合成 TP-5
• 2.3.4 游离氨基的检测
• 2.3.5 合成肽的侧链脱保护及提取合成肽
• 2.3.6 合成肽的纯化
• 2.3.7 合成肽的鉴定
• 2.3.8 E-玫瑰花结法生物活性检测
• 2.3.8.1 脱E 受体胸腺T 淋巴细胞的制备
• 2.3.8.2 绵羊红血球悬液的制备
• 2.3.8.3 供试品溶液的制备
• 2.3.8.4 实验分组及测定
• 2.3.8.5 观察结果
• 2.3.8.6 结果计算
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 固相肽合成
• 2.4.2 合成肽的鉴定
• 2.4.3 合成肽的纯度
• 2.4.4 玫瑰花结实验
• 2.4.4.1 玫瑰花结实验图片
• 2.4.4.2 计算结果
• 2.5 结论
• 第三章 胸腺五肽免疫学初步研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与动物
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 实验药物
• 3.2.1.2 实验试剂
• 3.2.1.3 实验动物
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 TP-5 的免疫原性的检测
• 3.3.1.1 动物分组与给药
• 3.3.1.2 免疫抑制小鼠脾指数和胸腺指数的检测
• 3.3.1.3 免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的检测
• 3.3.1.4 免疫抑制小鼠体内 T 淋巴细胞转化功能的测定
• 3.3.1.5 正常小鼠体外 T 淋巴细胞转化功能的测定
• 3.3.1.6 免疫抑制小鼠IL-2 水平的检测
• 3.3.1.7 免疫抑制小鼠血清溶血素生成能力的测定
• 3.3.2 TP-5 的免疫毒性的检测
• 3.3.2.1 动物分组与给药
• 3.3.2.2 大鼠脾指数和胸腺指数的检测
• 3.3.2.3 大鼠脾脏和胸腺的病理组织学检查
• 3.3.2.4 大鼠 T 淋巴细胞亚群的检测
• 3.3.3 统计学方法
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 TP-5 的免疫原性的检测结果
• 3.4.1.1 免疫抑制小鼠的脾指数和胸腺指数结果
• 3.4.1.2 TP-5 对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
• 3.4.1.3 TP-5 对免疫抑制小鼠体内T 淋巴细胞转化功能的影响
• 3.4.1.4 TP-5 对正常小鼠体外T 淋巴细胞转化功能的影响
• 3.4.1.5 TP-5 对免疫抑制小鼠IL-2 水平的影响
• 3.4.1.6 TP-5 对免疫抑制小鼠血清溶血素含量的影响
• 3.4.2 TP-5 的免疫毒性的检测结果
• 3.4.2.1 大鼠脾指数和胸腺指数检测结果
• 3.4.2.2 大鼠脾脏和胸腺的病理组织学检测结果
• 3.4.2.3 大鼠 T 淋巴细胞亚群的检测结果
• 3.5 结论
• 第四章 结论与展望
• 4.1 主要结论
• 4.2 课题展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文和取得的成果