蚯蚓体腔液及脱氧核糖核酸酶的抗菌机制研究

论文摘要

目的制备蚯蚓体腔液粗提物,检测粗提物的抗菌活性,确定其最低抑菌浓度和最低杀菌浓度。针对细菌结构逐步研究蚯蚓体腔液的抗菌作用机制。确立蚯蚓脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase）在蚯蚓固有免疫中的地位,分析蚯蚓DNase对细菌的作用。方法蚯蚓体腔液通过碳酸铵处理、丙酮沉淀等一系列步骤制备出体腔液粗提物。用液体培养基二倍稀释法测定蚯蚓体腔液粗提物最低抑菌浓度,再将无细菌生长的各培养管中的培养液分别移种在新鲜的琼脂糖平板上,测定最低杀菌浓度。通过检测疏水性荧光探针1-N-phenyl-naphtylamine （NPN）的荧光强度来测定体腔液对革兰氏阴性菌外膜的穿透作用。比浊法测定体腔液对肽聚糖的分解作用。用分光光度计监测邻硝基苯酚（ortho-nitrophenol, ONP）的生成,以测定体腔液对细菌内膜的透化作用。CATB法提取细菌基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳观察体腔液降解细菌基因组DNA的活性。用碱裂解法从产ESBL酶肺炎克雷伯菌中提取耐药质粒。琼脂糖凝胶电泳观察体腔液降解细菌耐药质粒DNA的活性。用量化细菌生物膜的标准实验检测蚯蚓DNase对生物膜的作用。分析蚯蚓DNase对体腔液的抗菌有无协同作用。结果蚯蚓体腔液有明确的抗菌活性。细菌诱导的体腔液的抗菌活性显著高于没有细菌诱导的体腔液。在一定时间范围内,体腔液对细菌外膜、内膜有时间依赖性穿透作用。体腔液能降解细胞壁中肽聚糖骨架,分解耐药质粒DNA、细菌基因组DNA。蚯蚓DNase在检测的各时间点均抑制细菌生物膜的形成,对体腔液有协同抗菌作用。结论蚯蚓体腔液对细菌有杀灭效应,但对各菌株作用有差异,说明体腔液的抗菌作用有选择性。蚯蚓体腔液的抗菌机制是通过对生物膜降解,透化细菌的外膜、内膜,降解细胞壁中肽聚糖成分,使细菌通透性增高,细菌内外物质失去平衡,推测蚯蚓DNase透过孔道进入胞浆降解遗传物质,造成细菌的彻底死亡。蚯蚓DNase是固有免疫中的重要防御分子,与其它活性成分协同抗菌。DNase为治疗耐药菌的感染提供了新的思路。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文名称缩略表 （Abbreviation）
• 前言
• 第一章 蚯蚓体腔液粗提物的制备及其抗菌活性的测定
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第二章 蚯蚓体腔液粗提物的抗菌活性的机制研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 蚯蚓体腔液粗提物中脱氧核糖核酸酶抗菌作用的初探
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四章 存在的问题和进一步研究的方向
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢