抗除草剂和多价抗虫基因导入水稻光温敏核不育系的研究

论文摘要

杂草和害虫的危害是导致水稻减产的重要原因,每年由此给全球水稻生产造成的损失高达数百亿美元。为了提高杂交水稻的抗虫性、方便直播制种和除草,避免人们对抗生素筛选标记的安全性顾虑,我们开展了抗除草剂、抗虫植物表达载体的构建和水稻光温敏核不育系的转化研究。抗除草剂、抗虫光温敏核不育系水稻培育成功,将有望在抗除草剂和抗虫杂交水稻培育、杂交水稻直播栽培和草害防治、杂交稻机械化制种中发挥重要作用。本文构建了包含抗除草剂基因Epsps和3个抗虫基因（马铃薯蛋白酶抑制剂基因Pin-II、苏云金杆菌毒蛋白基因Bt cryI（A）及雪花莲外源凝集素基因GNA）的植物表达载体。其中,除草剂基因Epsps不仅在实验中作为筛选标记基因方便进行筛选,而且可以使作物获得除草剂抗性而方便除草、直播和机械化制种。基因枪法和农杆菌介导转化法将连锁在一起的4个基因转化水稻光温敏核不育系7001S。通过基因枪转化法轰击1160块的愈伤组织得到167株再生植株,转化率17.4%。通过农杆菌介导转化法侵染270块的愈伤组织,获得6株再生植株,转化率2.2%。转基因再生植株的分子生物学鉴定表明,抗除草剂基因Epsps和抗虫基因已经整合到水稻基因组中,其拷贝数为1-2个。除出只有1～3个基因检出的植株,选出81个含有4个基因的转基因植株。部份植株中只含其中1～3个基因,可能是由于基因枪转化中部分片段发生丢失造成的。利用除草剂草甘膦处理含4个基因的转基因植株,它们表现出对草甘膦具有不同的抗性,推测是由于抗除草剂基因在不同个体中表达强弱不同所致。通过除草剂处理筛选,共获得具有草甘膦抗性且结实正常的转基因再生植株53株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 水稻抗虫基因工程的研究进展
• 1.1.1 苏云金杆菌（ Bt） 杀虫晶体蛋白基因
• 1.1.2 蛋白酶抑制剂基因
• 1.1.3 外源凝集素基因
• 1.2 草甘膦及其抗性植物研究进展
• 1.2.1 草甘膦的作用机理
• 1.2.2 EPSPS合成酶编码基因的研究进展
• 1.2.3 利用基因工程方法获得草甘膦抗性植物的研究
• 1.2.4 EPSPS酶基因在作物遗传育种上的应用前景
• 1.3 多基因转化策略在水稻转化中的研究应用
• 1.3.1 多基因抗性表达载体的构建
• 1.3.2 多基因转化策略的方法
• 1.4 本研究的目的和意义
• 1.4.1 本研究的目的
• 1.4.2 本研究的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验试剂
• 2.2.1 培养基的配制
• 2.2.2 常用的缓冲液和试剂成分的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 载体构建
• 2.3.2 水稻愈伤组织的遗传转化
• 2.3.3 转基因植株的分子检测
• 3 实验结果与分析
• 3.1 以Epsps 基因为筛选标记的多价抗虫基因表达载体的构建
• 3.1.1 中间载体pCTSM1300 的构建
• 3.1.2 中间载体pCT-PinII-1 的构建
• 3.1.3 中间载体pCT-Bt-2 的构建
• 3.1.4 载体pCTSKC3 的构建
• 3.1.5 大分子连接反应中的各组实验方案对比结果分析
• 3.2 转抗草甘膦基因和多个抗虫基因水稻植株的获得
• 3.2.1 水稻愈伤组织的诱导
• 3.2.2 水稻愈伤组织的转化——基因枪法
• 3.2.3 水稻愈伤组织的转化——农杆菌介导法
• 3.3 转基因植株的分子生物学鉴定
• 3.3.1 R0 代转基因植株的PCR 分析
• 3.3.2 R0 代转基因植株的PCR-Southern blot 分析
• 3.3.3 R0 代转基因植株的Southern blot 分析
• 3.4 转基因植株的草甘膦抗性鉴定
• 3.4.1 盆栽转基因植株离体叶片的草甘膦抗性试验
• 3.4.2 盆栽植株叶片草甘膦涂抹抗性试验分析
• 3.4.3 盆栽植株整株喷洒草甘膦抗性试验分析
• 4 讨论
• 4.1 多基因转化效率与转化方法的研究
• 4.2 启动子与基因高效表达的研究
• 4.3 转基因植株拷贝数检测方法的探讨
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文的情况