松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）热激转录因子（HSF）的分离及HSP70基因功能的RNAi分析

论文摘要

松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）是一种许多国家公认的外来入侵生物,可引起松树大量死亡,危害严重。本文从影响松材线虫逆境适应密切相关的热激转录因子和热激蛋白基因入手,利用RNAi技术分析其功能,以了解该基因在松材线虫环境适应过程中所发挥的作用,从而为进一步了解松材线虫本身的抗逆性及其生态适应性机理,揭示其成功入侵的内在机制提供理论依据,为将来开展松材线虫的防治工作提供新思路。根据热激转录因子保守结构域的特征,设计一对特异性引物,以松材线虫为模板,通过RT-PCR扩增得到一段282bp的cDNA序列,通过克隆、测序及在NCBI中比对后确证为松材线虫热激转录因子部分序列。根据获得的序列,设计新的引物,用3’RACE方法扩增获得3’端的1126bp碱基,通过拼接获得1408bp的热激转录因子部分序列,其中编码区为1305bp。利用RNAi分析热激蛋白HSP70的功能。将松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）的Bx-hsp-70基因（GenBank登录号为:DQ785812）和秀丽隐杆线虫（C.elegans）的hsp-70基因（GenBank登录号为:NM070667）用DNAman比对,用Primer和Oligo软件设计一对特异引物,并分别在上下游引物的5’端引入限制性内切酶位点XhoI和XbaI。进行RT-PCR扩增得到目的片段,将目的片段克隆到pGM-T载体中,测序验证后,利用引入的限制性内切酶位点XhoI和XbaI将目的片段克隆到含有T7启动子的LITMUS28i载体中,即获得可在体外合成dsRNA的载体。将此载体转化大肠杆菌HT115（RNA酶Ⅲ缺陷）,获得可诱导表达dsRNA的大肠杆菌菌株。利用T7RNA聚合酶体外合成dsRNA,纯化后分不同浓度用浸泡法将dsRNA导入松材线虫体内,48小时后处理终浓度为1.5mg/mL、2.0mg/mL和3.0mg/mL的校正死亡率分别为73.8%、98.19%和95.59%,结果显示2.0mg/mL浓度处理的线虫校正死亡率最高。用1.5mg/mL处理的线虫进行高温暴露实验和繁殖力实验,结果表明:高温暴露对经dsRNA浸泡线虫的致死表型有一定的影响,并降低了线虫的耐热性;繁殖能力明显下降,24小时处理后每条雌虫产卵量平均下降74.7%,48h处理后平均每条雌虫产卵量下降96.6%。2.0mg/mL处理48h后每条雌虫的产卵量平均下降83.9%,F1代每条雌虫的产卵量平均下降93%。半定量RT-PCR分析表明外源dsRNA浸泡能使部分松材线虫的靶标基因沉默。将诱导表达dsRNA的大肠杆菌菌株喂食秀丽隐杆线虫（C.elegans）,结果表明:C.elegans的迁移性明显降低,产卵量与对照相比下降了47%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 松材线虫及其危害
• 1.1 分类地位
• 1.2 形态特征
• 1.3 起源与分布
• 1.4 生活史
• 1.5 寄主范围及为害症状
• 1.6 松材线虫病的防治
• 2 热激转录因子研究进展
• 2.1 热激转录因子的基本结构
• 2.2 热激转录因子进化类型及功能
• 2.2.1 HSF1
• 2.2.2 HSF2
• 2.2.3 HSF3
• 2.2.4 HSF4
• 2.3 热激转录因子的转录调控
• 2.3.1 HSF的三聚化
• 2.3.2 HSF的核定位
• 2.3.3 HSF的磷酸化
• 2.3.4 Hsp对HSF的反馈调节
• 3 RNAi研究现状
• 3.1 RNAi的发现
• 3.2 RNAi的机制
• 3.3 RNAi技术的应用
• 3.3.1 RNAi与C.elegans
• 3.3.2 RNAi研究操作技术
• 3.3.3 RNAi在防治线虫病害上的应用
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 松材线虫HSF1基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试材料
• 1.1.2 主要试剂和酶类
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 常用试剂配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 松材线虫的培养与分离
• 1.2.2 总RNA提取
• 1.2.3 cDNA的合成
• 1.2.4 内参检测
• 1.2.5 HSF1基因片段的克隆
• 1.2.6 扩增片段的回收,克隆、测序
• 1.2.7 RACE全长cDNA的克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA的质量
• 2.2 内参检测
• 2.3 HSF基因保守片段扩增结果
• 2.4 HSF基因RACE结果
• 2.5 序列分析
• 3 结论与讨论
• 第三章 松材线虫热激蛋白基因（Bx-hsp-70）功能的RNAi分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试材料
• 1.1.2 主要试剂和酶类
• 1.2 直接干扰方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 总RNA的提取及cDNA模板的制备
• 1.2.3 热激蛋白基因（Bx-hsp-70）部分片段的克隆
• 1.2.4 表达载体的构建
• 1.2.5 LITMUS28i表达载体的质粒提取
• 1.2.6 cDNA线性模板的制备及纯化
• 1.2.7 体外转录合成dsRNA及dsRNA的纯化
• 1.2.8 dsRNA处理线虫
• 1.2.9 RNAi表型分析
• 1.2.10 繁殖力影响实验
• 1.2.11 转录分析
• 1.3 交叉干扰方法
• 1.3.1 引物设计、总RNA的提取及基因片段的克隆
• 1.3.2 HT115感受态细胞的制备
• 1.3.3 表达载体的构建
• 1.3.4 dsRNA的诱导、检测
• 1.3.5 秀丽隐杆线虫的培养及同步化
• 1.3.6 秀丽隐杆线虫的实验处理及RNAi及表型观察
• 2 结果与分析
• 2.1 直接干扰结果与分析
• 2.1.1 PCR扩增结果及dsRNA表达载体的构建
• 2.1.2 Hsp70基因的RNAi表型分析结果
• 2.1.3 dsRNA处理对线虫繁殖力的影响
• 2.1.4 RT-PCR分析
• 2.2 交叉干扰结果与分析
• 2.2.1 dsRNA的诱导和鉴定
• 2.2.2 dsRNA处理表型观察
• 2.2.3 dsRNA对秀丽隐杆线虫繁殖能力的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录A:缩略词表
• 附录B:常用缓冲液及培养基配方
• 致谢
• 作者简介