低氧通过低氧诱导因子1（HIF-1）调控二价金属转运体1（DMT1）的表达

论文摘要

目的:研究低氧对培养细胞二价金属转运体1（Divalent metal transporter 1, DMT1）转录和蛋白表达的影响,探讨低氧诱导因子1（Hypoxia inducible factor-1, HIF-1）对DMT1的表达调控。方法:①用1%O2和CoCl2诱导人肝癌细胞HepG2缺氧。②用Western Blot法检测细胞HIF-1α和DMT1的表达。③利用免疫细胞化学法检测低氧对HIF-1α及DMT1两种异构体在HepG2细胞内的分布影响。④构建表达HIF-1α质粒pHIF-1α。构建萤光报告基因质粒pDMT1-436和pDMT1-171。利用定点突变技术,将质粒pDMT1-171片段中ACGTG突变为AAATG,构建成质粒pDMT1-171m。构建的质粒均通过测序鉴定。⑤利用报告基因、构建表达质粒pHIF-1α和定点突变的方法,测量luciferase的萤光值反映低氧对HepG2细胞和星形胶质细胞DMT1转录水平的影响。结果:①1%O2处理HepG2细胞6小时,可使细胞HIF-1α蓄积和DMT1两种异构体表达增加。常氧下转染质粒pHIF-1α的HepG2细胞中,HIF-1α和DMT1两种异构体表达量均增加。②在常氧环境中,DMT1两种异构体在HepG2细胞胞浆和胞核中均匀分布,HIF-1α无明显表达。低氧（1%O2）可使HIF-1α大量集中分布于细胞核,+IRE DMT1趋向于胞浆,而-IRE DMT1没有明显改变。③通过MatInspector软件分析人类DMT1启动子区,发现1个疑似低氧反应元件（Hypoxia response element, HRE）的序列,位于-327-323 （ACGTG）。由于HRE的特征序列为5’-R（A/G）CGTG-3’,经目测分析,在启动子区-175-171和-143-139处各存在一个GCGTG。以萤光报告基因质粒为载体分别构建包含上述三个疑似HRE和仅包含ACGTG片段的质粒,分别命名为pDMT1-436和pDMT1-171。④转染萤光报告基因质粒pDMT1-436的HepG2细胞和星形胶质细胞在1%O2处理6小时和（或）400μM CoCl2处理4小时后,其萤光值都明显增高,表明DMT1启动子区上含有功能性HRE。⑤转染萤光报告基因质粒pDMT1-436和pDMT1-171的HepG2细胞在1%O2处理6小时后,其萤光值均明显增高,且pDMT1-436和pDMT1-171两组的萤光值比较没有统计学差异,表明pDMT1-171质粒含有功能性HRE。⑥转染萤光报告基因pDMT1-171m的HepG2细胞在1%O2处理6小时或400μM CoCl2处理4小时后,其萤光值和对照组比较没有统计学差异,进一步确定在DMT1启动子区上位于-327-323（ACGTG）的序列是功能性的HRE。⑦在HepG2细胞内转染表达HIF-1α的质粒pHIF-1α和萤光报告基因质粒pDMT1-171/ pDMT1-171m,常氧下pDMT1-171的萤光值明显增加,而pDMT1-171m的萤光值和对照组比较没有统计学差异。结论:①低氧（1%O2）和常氧下给予外源性HIF-1α均可使HepG2细胞HIF-1α蓄积和DMT1两种异构体表达增加,变化趋势基本一致。提示DMT1的基因表达可能受HIF-1α调控,DMT1可能是HIF-1的靶基因。②低氧（1%O2）可以使HepG2细胞中DMT1两种异构体在细胞内的分布发生不同的改变,提示这两种异构体在低氧时功能不完全一致。③通过萤光强度比较和定点突变进一步确定在人类DMT1基因启动子区上仅含有一个位于-327-323（ACGTG）的序列是功能性HRE。④常氧下外源性HIF-1α可以使pDMT1-171萤光值增强,说明HIF-1α在低氧调控DMT1中起关键作用,低氧是通过HIF-1调控DMT1表达。

论文目录

• 英文缩略词表（Abbreviation）
• 中文摘要（Abstract in Chinese）
• 英文摘要（Abstract in English）
• 前言（Introduction）
• 材料和方法（Material and Method）
• 结果（Results）
• 讨论（Discussion）
• 结论（Conclusion）
• 参考文献（References）
• 综述（Review）
• 综述参考文献（References）
• 致谢（Acknowledgements）