论文摘要
目的家族性高胆固醇血症（familial cholesterolemia,FH）的致病基因是位于19号染色体上的低密度脂蛋白受体（LDLR）基因,大多为点突变,是最常见的单基因遗传病之一,属公认的遗传性疾病基因治疗的首选病种。已进行的研究表明现行的基因治疗方法在安全性和持久性方面尚有不少问题。新近报道的对点突变进行染色体（靶向）原位修复是一种全新的理念,有望获得重大突破。修饰的单链DNA寡核苷酸（modified single-stranded DNA oligonucleotide,MSO）被证实可以较低频率地修复报告基因中的点突变。本研究的目的是建立LDLR基因点突变的细胞模型,进行MSO靶向基因原位修复试验,为探索FH的基因治疗打基础,由此建立的策略方法也适用于其他以点突变为主的单基因遗传性疾病,具有较高理论价值和应用前景。同时本研究还建立了LDLR基因四环素调控稳定细胞系,为研究LDLR基因功能和FH的基因治疗提供了新的细胞模型。方法低密度脂蛋白受体基因点突变细胞模型构建为了构建质粒表达载体pIRES-Hyg-WT-LDLR-EGFP、pIRES-Hyg-556-LDLR-EGFP和pIRES-Hyg-660-LDLR-EGFP,人低密度脂蛋白受体基因的cDNA编码序列被插入到质粒表达载体pIRES-Hyg的多克隆位点。WT即野生型LDLR基因,556是LDLR基因在12外显子1730位有G→C点突变,660是LDLR基因在14外显子2043位有C→A点突变。三种质粒表达载体分别制备,纯化后的质粒DNA通过脂质体介导分别转染CHO、HepG2和Vero细胞,600μg/mlHygromycin筛选抗性细胞克隆,通过（1）荧光显微镜观察EGFP的表达;（2）提取阳性克隆细胞的基因组作为模板,PCR鉴定SNP位点;（3）western blot检测LDLR-EGFP融合蛋白的表达;（4）检测LDLR受体对Dil标记的人低密度脂蛋白（DiI-LDL）的摄取功能;对构建的稳定细胞模型进行鉴定。低密度脂蛋白受体基因点突变原位修复对构建的稳定细胞模型Vero-660的LDLR基因点突变进行原位修复,以突变点为中心,分别合成15 nt、25 nt、31 nt、35 nt和45 nt长度,末端6个碱基硫代修饰的MSO,每个长度的链合成4条,分别为两条修复链:与编码链一致为反义链;与模板链一致为正义链;两条对照链:C链与编码链一致,但未纠正突变位点;NC链为无关对照链。利用脂质体转染细胞系,流式细胞仪检测细胞EGFP的表达,初步确定修复效率。通过流式细胞仪分选EGFP+细胞,利用Dil-LDL内移实验验证LDLR的功能,培养一定时间后,提取核酸和蛋白质分别进行焦磷酸测序分析和Western Blot检测,确定最终的修复效率。低密度脂蛋白受体基因调控表达首先构建质粒表达载体pIRES-TetR-Hyg,即以pcDNA6/TR质粒核酸为模板,设计引物,PCR扩增Tet R片段,插入到质粒表达载体pIRES-Hyg的多克隆位点。同时构建质粒表达载体pCDNA4/TO-WT-LDLR-EGFP,即人低密度脂蛋白受体基因的cDNA编码序列插入质粒表达载体pCDNA4/TO的多克隆位点,WT即野生型LDLR基因。将构建好的两种质粒表达载体pIRES-TetR-Hyg和pCDNA4/TO-WT-LDLR-EGFP通过脂质体介导分别共转染CHO和HepG2细胞,用600μg/ml Hygromycin和400μg/ml Zeocin筛选抗性细胞克隆。以2μg/ml四环素诱导LDLR基因表达,通过（1）荧光显微镜观察EGFP的表达;（2）western blot检测LDLR-EGFP蛋白的表达;（3）检测LDLR受体对DiI-LDL的摄取功能;对构建的低密度脂蛋白受体基因调控细胞模型进行鉴定。结果实验结果显示野生型和点突变LDLR基因的稳定转染细胞模型构建成功,稳定转染pIRES-Hyg-WT-LDLR-EGFP质粒的细胞系,分别命名为HepG2-WT、CHO-WT和Vero-WT;稳定转染pIRES-Hyg-556-LDLR-EGFP质粒的细胞系,分别命名为HepG2-556、CHO-556和Vero-556;稳定转染pIRES-Hyg-660-LDLR-EGFP质粒的细胞系,分别命名为HepG2-660、CHO-660和Vero-660。其中HepG2-WT、CHO-WT和Vero-WT细胞系中有正常野生型LDLR基因,而LDLR受体是膜受体,因此荧光显微镜下可观察到荧光主要分布在细胞膜上,将Dil标记的人低密度脂蛋白与细胞相互作用后,激光共聚焦显微镜观察结果显示,外源性的低密度脂蛋白受体具有正常的与配基相结合的功能。同时Western blot结果进一步提示,细胞中有大量的外源性低密度脂蛋白受体蛋白的表达。HepG2-556、CHO-556和Vero-556细胞系中的LDLR基因在12外显子1730位有G→C点突变,由于该突变,导致LDLR受体虽然能表达但不能定位于细胞膜,因此荧光显微镜下可观察到荧光主要分布在细胞质中。HepG2-660、CHO-660和Vero-660细胞系中的LDLR基因在14外显子2043位有C→A点突变,该突变导致提前出现终止密码子,使LDLR受体及下游的EGFP蛋白均无法表达,因此荧光显微镜观察无荧光可见。对构建的稳定细胞模型Vero-660的LDLR基因点突变进行原位修复,由于Vero-660的LDLR基因点突变属于无义突变,能较简便判别修复效率,不能修复者,突变位点下游部分均不能表达。凡能纠正该点突变者即可获得包括EGFP的完整表达产物,修复效率越高,EGFP的表达越多。本研究以此为模型,通过流式细胞仪检测EGFP的表达,分析比较不同MSO的修复效果,结果发现35 A-MSO具有较好的效果,EGFP阳性比例为4.99±0.74%。但通过Pyrosequencing测序,结果显示荧光转阳细胞克隆的突变修复率为10.72±0.93%,因此确切的突变修复率应为0.53%左右。实验结果还显示我们成功构建了LDLR基因四环素调控表达细胞模型,HepG2和CHO四环素调控细胞分别命名为HepG2-TetR-WT,CHO-TetR-WT。调控细胞加入四环素前,荧光显微镜观察无绿色荧光可见,加入四环素后,荧光显微镜可见细胞内有大量绿色荧光,且荧光主要分布在细胞膜上,将Dil-LDL与细胞相互作用后,激光共聚焦显微镜观察结果显示,外源性的低密度脂蛋白受体具有正常的与配基相结合的功能。同时Western blot结果进一步提示,细胞中有大量的外源性低密度脂蛋白受体蛋白的表达,表明构建的细胞模型LDLR基因受四环素调控且不影响受体功能。结论成功制备LDLR基因点突变的多种细胞模型,使用简易有效的MSO对LDLR的点突变进行定点原位修复方面开展研究,为探索FH安全有效的基因治疗新途径打下基础。四环素调控的LDLR基因稳定细胞系的建立,为研究LDLR基因功能和FH的基因治疗提供了新的细胞模型。
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标签：家族性高胆固醇血症论文; 低密度脂蛋白受体论文; 基因修复论文; 修饰的单链寡核苷酸论文; 诱导表达论文; 四环素调控论文;